雌、雄海马抗疲劳和改善记忆障碍比较

唐海婷，张 才，张永平，杨隆恩，古敏晴，李亚娟，颜 玲，宋 采



雌、雄海马抗疲劳和改善记忆障碍比较

唐海婷，张 才，张永平，杨隆恩，古敏晴，李亚娟，颜 玲，宋 采

（广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120）

【】比较雌、雄海马对小鼠抗疲劳和改善记忆障碍的不同作用。转棒实验检测小鼠抗疲劳能力，将小鼠分3组，1组喂食普通饲料，另外2组分别喂食含有质量分数0.22%雌、雄海马的饲料，共喂食6周。跳台实验检测小鼠记忆能力，将小鼠为4组，正常组与乙醇组喂食普通饲料，另外2组分别喂食含有质量分数0.22%雌、雄海马的饲料，共喂食6周。体积分数30%乙醇灌胃乙醇组和雌、雄海马组诱导小鼠记忆损伤模型。抗疲劳实验中，与对照组相比，喂食雄海马的小鼠在棒时间显著延长（＜0.05），其血清中乳酸含量显著降低（＜0.05）；而喂食雌海马的小鼠在棒时间和血清乳酸含量均无明显改变。乙醇记忆损伤实验中，与对照组相比，模型组小鼠跳下平台的潜伏期显著下降（＜0.01），错误数（次）显著升高（＜0.01）；与模型组相比，喂食雄海马的小鼠跳下平台的潜伏期显著升高（＜0.05），错误数（次）显著减少（＜0.05），脑组织中的乙酰胆碱酯酶活性显著降低（＜0.05）；而喂食雌海马的小鼠上述指标均无改变。在增强小鼠抗疲劳能力和改善记忆方面，雄海马的功效显著而雌海马无效。

雌、雄海马；抗疲劳；改善记忆

随着现代生活节奏的加快，疲劳的产生对人们生活质量产生了越来越大的影响。延缓疲劳发生，迅速消除疲劳，对人们身体健康极为重要[1]。学习记忆是大脑重要功能之一，也是人类赖以生存和进化的关键。由外力、环境污染以及酒精等引起的记忆损伤，特别是因酒精引起的记忆损害越来越多，会严重危及人类的正常生活工作，造成严重经济负担。由于海洋的独特环境，许多海洋药物具有高效的活性和特殊的药理作用机制，在抗疲劳和记忆改善方面的作用日益受到人们的重视[2]。

海马入药历史悠久，药理作用广泛，除性激素样作用[3-4]外，还具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲劳和抗癌[6]、抗抑郁[7]等作用。三斑海马能显著延长小鼠负重游泳时间，减少运动过后的乳酸生成并加速乳酸代谢，其抗疲劳效果优于人参[8]。“深海龙”是一种含有海马有效成分的水丸，服用后能显著提高人体无氧功率、定量负荷以及极限负荷工作能力[9]。药理研究发现海马水、醇提取物能在一定程度上改善记忆[10]。小鼠妊娠晚期，一次性灌胃谷氨酸单钠，可明显降低60日龄仔鼠Y迷宫学习记忆能力[11]。从三斑海马中分离出的一种肽类初制剂，可拮抗谷氨酸单钠的上述作用[12]。三斑海马中分离出的一种小分子多肽能抵抗Aβ诱导的神经毒性，有望治疗老年痴呆[13]。此外，海马富含DHA、EPA ω-3多不饱和脂肪酸对大脑有很好保护作用的成分[14]。

目前对《中国药典》2015版收录的5种高药用价值海马的研究，主要是三斑海马，但三斑海马养殖较为困难，难以满足市场需求。而线纹海马因抗病能力强、存活率高、生长速率快优点[15]，成为近年来的养殖首选。同时线纹海马较三斑海马异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高，这些成分对维护机体健康，增强免疫力有重要作用[16]。目前关于线纹海马的研究主要集中在抗炎[17]方面，且传统中药习惯将线纹海马雌雄配对入药[18]，单雄性或单雌性海马功效研究尚未见报道。本研究以单雌性和单雄性海马饲喂小鼠，利用转棒实验和急性乙醇记忆损伤模型，分析雌、雄海马对小鼠增强疲劳耐受和改善记忆的功效，并通过测定血清中乳酸（LA）含量反映小鼠疲劳程度，脑组织中乙酰胆碱酯酶（AChE）以及乙酰胆碱转移酶（ChAT）活性反映小鼠与学习记忆有关的胆碱能系统变化，以期进一步阐明线纹海马功效的机制，为线纹海马保健品和药品开发研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

无特定病原体（SPF级）六周龄雄性昆明种小鼠，体质量22 ~ 24 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司（合格证号：37009200008874）。小鼠饲养于SPF级动物房，温度（23±1）℃，湿度（50±10）%，12 h光照（7：00—19：00），自由饮食和摄水。小鼠适应环境7 d后开始实验，此时小鼠体质量均值为33 g。线纹雌海马、线纹雄海马，由深圳市万骐海洋生物科技有限公司提供。YLS-4C 转棒式疲劳仪，济南益延科技发展有限公司；XR-3TB 跳台实验系统，上海欣软信息科技有限公司；高速冷冻台式离心机，Beckman公司；RT-6100酶标仪，Rayto公司。无水乙醇，成都市科龙化工试剂厂。ELISA试剂盒LA、AChE、ChAT，产品批号分别为20170705536T、20170711258T、20170702163T，由江苏雨桐生物科技有限公司提供。海马饲料由海马粉末与普通粉末饲料按比例混合均匀，混合后的饲料4℃下储存，小鼠食用饲料每天更新，避免海马氧化。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 海马抗疲劳实验共分3组（= 15）：对照组饲喂普通饲料，雌海马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料，雄海马组饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马记忆改善实验共分4组（= 15）：对照组以及乙醇组饲喂普通饲料，雌海马组饲喂质量分数0.22%的雌海马饲料，雄海马组饲喂质量分数0.22%的雄海马饲料。海马粉末不溶于水，故采取拌饲料喂食的方式，该方法成熟，应用广泛[19]。两个实验均喂食海马饲料6周，记录初始体重，之后每周末称重一次。

1.2.2 小鼠转棒实验[20]先进行为期3 d的适应性预实验，每天将小鼠放置在转棒疲劳仪上，设置转棒疲劳仪转速20 r/min，时间10 min。如有小鼠中途掉落，则将小鼠放回转棒上继续适应。正式实验中，设定转速40 r/min，记录5 min内小鼠从开始到掉棒的时间。本实验为一次性测试结果。

1.2.3 跳台实验[21]体积分数30%的乙醇以10 mL/kg的剂量在实验前1 h灌胃乙醇组和雌、雄海马组，造成急性乙醇中毒所致记忆损伤造模。跳台实验时，将小鼠放置在平台上，自由探索试验箱3 min，后将小鼠放置在箱内铜栅上，铜栅通电（30 mA恒流）以刺激小鼠找到平台。24 h后正式测试，记录5 min内小鼠第一次跳下平台的时间，即潜伏期，以及5 min内小鼠跳下平台的总数（次），即错误数（次）。本实验为一次性测试结果。

1.2.4 样品采集 转棒实验结束30 min后，小鼠断头颈部取血，全血静置0.5 h，以转速3 000 r/min 离心10 min，保存血清于-80 ℃冰箱。跳台实验结束24 h后，小鼠断头，迅速将全脑剥离，液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱。

1.2.5 生化指标测定 根据ELISA试剂盒说明书，测定抗疲劳实验小鼠血清LA 含量，记忆障碍实验小鼠全脑AChE和ChAT活性。

2 实验结果

2.1 雌、雄海马对小鼠体质量影响

图1可知，实验前，各组小鼠体质量没有差异（＞0.05）。饲养6周后，各组小鼠的体质量均有增加，但与对照组相比，饲喂雌、雄海马的小鼠体质量均无显著差异（＞0.05），说明雌、雄海马对小鼠的正常生长并无影响。

图1 雌、雄海马对小鼠体质量的比较

2.2 雌、雄海马饲喂对小鼠抗疲劳耐受时间影响

小鼠从开始到掉棒的持续时间越长，表示小鼠耐受时间越长，抗疲劳能力越强。图2显示，与对照组相比，雌海马组的耐受时间无显著差异（＞0.05），雄海马组的耐受时间则显著升高（=7.353，＜0.05），说明仅雄海马能增强小鼠抗疲劳能力。

*，VS对照组control group P＜0.05

2.3 雌、雄海马饲喂对小鼠血清中乳酸LA影响

图3显示，雄海马对血清乳酸水平有显著效果（（2,42）=3.465，＜0.05）。与对照组相比，雌海马组的血清LA水平无显著差异（＞0.05），雄海马组的血清LA水平则显著降低（＜0.05）；与雌海马组相比，雄海马组的血清LA水平也显著降低（＜0.05）。结果表明雄海马能有效降低运动疲劳后小鼠体内LA含量。

*，VS对照组P＜0.05；#，VS雌海马组P＜0.05

2.4 雌、雄海马对小鼠跳台潜伏期和错误数（次）影响

图4显示，雄海马对乙醇诱导的跳台潜伏期有显著改善效果（=29.364，＜0.01）。与对照组相比，乙醇组的潜伏期显著降低（＜0.01）；与乙醇组相比，雌海马组的潜伏期无明显升高（＞0.05），雄海马组的潜伏期则显著升高（＜0.01）。表明30%乙醇灌胃能造成小鼠记忆损伤，雄海马能显著改善这种记忆障碍，而雌海马无效。

**，VS对照组P＜0.01；##，VS乙醇组P＜0.01

图5显示，海马对乙醇诱导的跳台错误数（次）有显著改善效果（（3,56）=12.315，＜0.01）。与对照组相比，乙醇组的错误数（次）显著升高（＜0.01）；与乙醇组相比，雌、雄海马组的错误数（次）均显著降低（＜0.05）。表明对于乙醇造成的记忆损伤，雌、雄海马能部分进行改善。

**，VS对照组P＜0.01；#，VS乙醇组P＜0.05

2.5 雌、雄海马对小鼠脑内乙酰胆碱酯酶AChE和乙酰胆碱转移酶ChAT活性影响

图6显示，海马对乙醇诱导的AChE活性有显著改善效果（（3,56）=13.535，＜0.05）。与对照组相比，乙醇组AChE活性显著升高（＜0.01）；与乙醇组相比，雄海马组AChE活性显著降低（＜0.05）。结果表明，乙醇能导致小鼠脑内AChE活性上升，雄海马能逆转这一影响。

**，VS对照组P＜0.01；#，VS乙醇组P＜0.05

图7显示，与对照组相比，乙醇诱导使得脑内ChAT活性显著降低（（3,56）=5.656，＜0.05）；但是与乙醇组相比，雌、雄海马两个组ChAT活性均没有变化（＞0.05）。结果表明，乙醇造成的记忆损伤会使脑内ChAT活性下降，但是雌、雄海马对这一变化并无改善作用。

*，VS对照组control group P＜0.05

3 讨论

运动耐力是反映机体疲劳最直接客观的指标，运动耐力的增强是抗疲劳能力增强的最有力表现。小鼠转棒实验是一种强迫全身消耗性实验，其运动时间的长短是衡量疲劳的一个指标[22]。乳酸是机体在无氧条件下进行糖代谢的终产物，剧烈运动时机体会产生大量乳酸，乳酸的积累会导致机体疲劳，可反映机体疲劳程度[23]。在本研究中，雄海马表现出对血乳酸的清除作用，提高了机体对氧的利用能力，降低了无氧酵解程度，从而延长了小鼠运动耐受时间。彭汶铎等[24]也发现小鼠连续14 d灌胃海马酶解提取物，在一次性运动和递增运动量疲劳模型中，小鼠血清中乳酸含量均显著降低。但是饲喂雌海马的小鼠，其耐受时间与血清乳酸含量与对照组相比，并无明显变化，证明单独的雌海马不能改善小鼠的运动机能，没有抗疲劳作用。

跳台实验是检测动物学习记忆能力的常用方法，跳台潜伏期和错误数（次）是评价动物学习记忆的重要指标。潜伏期长，错误数（次）少，表明动物的学习记忆能力强。本研究中，30%乙醇灌胃对小鼠的学习记忆能力造成了损伤。一次性饮入过量乙醇，能引起中枢神经系统由兴奋转为抑制状态，首先作用于大脑皮层，然后累及皮层下中枢和小脑，导致记忆力下降[25]。乙醇对中枢神经系统的损伤机制比较复杂，其中之一是对胆碱能系统的影响[26]。而中枢胆碱能系统则与学习记忆密相关，胆碱能系统的重要神经递质乙酰胆碱（ACh），其释放量随着学习与记忆、探究行为等认知活动的发生而随之改变。ChAT对ACh的合成起着催化作用，而AChE则参与脑内ACh的分解，使神经递质对突触后膜的兴奋作用终止，保证神经传递正常。在大脑内，ChAT和AChE共同维持着ACh的动态平衡[27]。由于ACh性质极不稳定，容易水解，故通过检测ChAT和AChE的活性间接来反映ACh的含量。从实验结果可知，乙醇组ChAT活性降低，AChE活性升高，即ACh分解加快而合成减少，AChE总体水平降低，学习记忆受损。从行为上看，饲喂雄海马的小鼠其学习记忆有所改善，潜伏期增加，错误数（次）减少；而饲喂雌海马的小鼠，学习记忆能力并未改善。生化指标则显示，饲喂雄海马的小鼠其脑内AChE活性与乙醇组相比显著降低，ChAT活性则无明显变化，提示雄海马对学习记忆的改善可能是通过抑制ACh分解而非加速其合成，此外在不同记忆损伤模型小鼠中，利用不同中药如夏天无和刺五加，均显示可通过抑制AChE来达到记忆改善的效果[28-29]；由于雌海马未能改善乙醇造成的学习记忆损伤，所以与乙醇组相比，饲喂雌海马的小鼠其脑内ChAT和AChE活性也无改变。

本研究存在以下两点不足：1. 评价抗疲劳经典药效学实验有转棒疲劳和负重游泳，评价记忆改善的有跳台，避暗及水迷宫实验。目前本实验只各采用了其中一种方法。2. 实验中所用海马为粉末粗材料，应该找出其中的有效成分进行实验。接下来笔者及研究团队将对雌、雄海马成分进行更深入的分析，优化海马提取物，完善实验方案，为更准确、更好地利用海马资源提供理论依据。

4 结论

雄海马可以通过降低体内乳酸含量，增强小鼠的抗疲劳能力；通过抑制乙酰胆碱酯酶，改善小鼠的学习记忆能力；而单独的雌海马则没有上述功能。雄海马在抗疲劳和改善记忆方面的效果显著而雌海马无效。

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Comparison Between male and Female Sea Horse in the Anti-fatigue and Memory Improvement

TANG Hai-ting, ZHANG Cai, ZHANG Yong-ping, YANG Long-en, GU Min-qing, LI Ya-juan, YAN Ling, CAI Song

（,,,524000,;,,518120,）

【】To compare the different effects of male and female sea horse in the anti-fatigue and memory improvement in mice.【】The rotarod test was used to test anti-fatigue ability in mice and they were divided into three groups. One group was fed with normal fodder, and the other two groups were fed with 0.22% female and male sea horse for 6 weeks respectively. Step down test was used to test the ability of learning and memory in mice, and they were divided into four groups. The control group and the model group were fed with normal fodder, and the other two groups were fed with 0.22% female and male sea horse for 6 weeks respectively. To induce memory impairment, 30% ethanol was applied through intragastric administration in the model, female and male sea horse groups.【】In the anti-fatigue experiment, male sea horse significantly prolonged the time that the mice remained on the rotating rod（< 0.05）and decreased the serum lactic acid concentration significantly（< 0.05）,but the female sea horse did not show the same results. Comparing with the control group in the memory impairment experiment, the latency dropped significantly in the model group（< 0.01）, and the number of errors was increased significantly (< 0.01). Comparing with the model group, the latency was significantly increased（< 0.05）and the number of errors was significantly reduced（< 0.05）in the male sea horse group. The activity of acetylcholinesterase in the brain tissue was significantly lower too（< 0.05）. There was no difference between the female sea horse group and the model group.【】The effect of male sea horse is significantly better than that of female sea horse in enhancing the anti-fatigue ability and improving memory.

female and male sea horse; anti-fatigue; memory improvement.

Q954.4

A

1673-9159（2019）03-0103-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.014

2019-01-24

深圳万骐海洋生物技术有限公司合作项目“海马高值化综合利用研究”; 湛江市科技攻关计划项目“脑健康相关海洋药物与营养品重点实验室”

唐海婷（1994—），女，硕士研究生，主要从事精神神经免疫学和海洋生物活性物质研究。E-mail:2637573867@qq.com

宋采，女，教授，研究方向为精神神经免疫学和海洋活性物质药理学。E-mail:cai.song@dal.ca

唐海婷，张才，张永平，等. 雌、雄海马抗疲劳和改善记忆障碍比较[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（3）：103-108.

（责任编辑：刘朏）