COPD患者外周血SIRT1及NF-KB、MMP-9的表达水平分析

(荆门市第一人民医院1.检验科，2.妇科，3.全科医学，湖北 荆门 448000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病，多发于中老年人群[1]。目前已有的治疗方案仍无法完全抑制病情发展，在降低患者死亡率方面效果不佳[2]。探索COPD病情发展中的特异性生物标志物和相关信号通路对阐明发病机制，对开发新的治疗药物，改善患者治疗预后具有重要意义。近年来研究发现，沉默信息调节因子相关酶1(Silence Information Regulator Related Enzyme 1，SIRT1)在细胞应激反应调控中发挥关键作用[3]，且与神经性病变、糖尿病等多种年龄相关疾病的发生、发展密切相关[4]。但SIRT1在COPD病情发展中的研究仍鲜有报道。本文通过分析COPD患者外周血中SIRT1和炎症因子：核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的表达水平，探讨SIRT1在COPD病情发生、发展中的可能调控机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月至2017年12月间本院收治的COPD急性加重期患者80例，其中男性45例、女性35例，年龄51～79岁，平均年龄(65.30±7.62)岁。另取同期稳定期COPD患者60例，其中男性36例、女性24例，年龄50～76岁，平均年龄(64.15±6.95)岁。纳入标准：符合中华医学会制定的慢性阻塞性肺疾病诊治指南(2013修订版)中的诊断标准；COPD急性加重期判断标准：PCO2>50 mmHg，合并PO2<60 mmHg、呼吸频率>30次/分，呼吸困难、咳嗽等临床症状明显加重。排除标准：①合并肺炎、哮喘、肺栓塞、肺结核的患者；②合并肝肾功能严重障碍，恶性肿瘤，自身免疫性疾病的患者。选取同期在本院体检的健康中老年人60例为对照组，其中男性34例、女性26例，年龄50～75岁，平均年龄(64.90±6.31)岁。三组性别、年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会审核批准，患者及健康体检者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

SIRT1、NF-κB、MMP-9 Elisa试剂盒购于上海联迈生物工程有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购于北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂、BCA试剂盒均购于上海康朗生物科技有限公司；兔抗人SIRT1、NF-κB、MMP-9、β-actin多克隆抗体、兔抗人IgG(HRP标记)购于上海北诺生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肺功能检测 分别于COPD急性加重期患者治疗前、稳定期COPD患者和对照组受试者入院时，使用GERATHERM肺功能测试仪测定用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼气容积(FEV1)及占预估值的百分比(FEV1%)。检测前24h COPD患者未使用支气管扩张剂。

1.3.2 样品采集与血清SIRT1、NF-κB、MMP-9检测 COPD急性加重期患者治疗前、稳定期和对照组受试者入院时采集清晨空腹肘静脉血5 mL，取其中2 mL室温下2 000 r/min离心20 min，分离上层血清，Elisa法检测SIRT1、NF-κB、MMP-9水平，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 外周血单核细胞分离 取外周血3 mL，2 000 r/min离心10 min，收集血细胞，加入人外周血淋巴细胞分离液，收集单核细胞，磷酸缓冲液洗涤3次，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，以1×106/L细胞浓度接种于6孔板中，放入37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中培养24 h，收集贴壁的单核细胞。

1.3.4 RT-PCR检测SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA表达Trizol法提取外周血单核细胞总RNA，逆转录得到cDNA。SIRT1、NF-κB、MMP-9及内参β-actin引物合成由上海斯信生物科技有限公司完成，SIRT1引物序列：上游5′-TTAAGCGTCGAATATCAGAACT-3′，下游5′-GTGGGAAGAGGTC ATCAGGAG-3′；NF-κB引物序列：上游5′-CTCATGG TCAACGCCAAGTG-3′，下游5′-CCTGTAGCGATGCGTCGAG-3′；MMP-9引物序列：上游5′-GTATTGTC GTCTCCGTAAGGC-3′，下游5′-CTGCTCCGTTCTCAAAGTGGAA-3′；内参β-actin引物序列：上游5′-CAAGAGTCGG AACTGCCAC G-3′，下游5′-AGGTGA CCGCAGAAGTGGT-3′。反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，延伸72 ℃ 10 min。扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，计算SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA的相对表达量。

1.3.5 Western blot检测SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白表达 外周血单核细胞中加入RIPA蛋白提取剂，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min后取上清，BCA法蛋白定量，定量后的总蛋白加入适量缓冲液，行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法电转移将蛋白转膜到PVDF，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别滴加兔抗人Sirt1多克隆抗体(1:200)、兔抗人NF-κB多克隆抗体(1∶200)、兔抗人MMP-9多克隆抗体(1∶200)、兔抗人β-actin多克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，滴加HRP标记的兔抗人IgG(1∶1 000)，室温孵育1 h，ECL显色，暗室中显影，分析各条带灰度值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 三组肺功能检测指标比较

COPD稳定期组和急性加重组患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%明显低于对照组(P<0.05)；COPD急性加重组患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%明显低于COPD稳定期组(P<0.05)。见表1。

表1 三组肺功能检测指标比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与COPD稳定期组相比，bP<0.05

2.2 三组血清SIRT1、NF-κB、MMP-9水平比较

COPD稳定期组和急性加重组患者血清SIRT1水平明显低于对照组，COPD急性加重组明显低于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD稳定期组和急性加重组患者血清NF-κB、MMP-9水平明显高于对照组，COPD急性加重组明显高于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 三组血清SIRT1、NF-κB、MMP-9水平比较 (ng/mL)

注：与对照组相比，aP<0.05；与COPD稳定期组相比，bP<0.05

2.3 三组SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA表达水平比较

COPD稳定期组和急性加重组患者SIRT1 mRNA相对表达量明显低于对照组，COPD急性加重组明显低于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD稳定期组和急性加重组患者NF-κB、MMP-9 mRNA相对表达量明显高于对照组，COPD急性加重组明显高于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 三组SIRT1、NF-κB、MMP-9 mRNA相对表达量比较

注：与对照组相比，aP<0.05；与COPD稳定期组相比，bP<0.05

2.4 三组SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白水平比较

COPD稳定期组和急性加重组患者SIRT1蛋白相对表达量明显低于对照组，COPD急性加重组明显低于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD稳定期组和急性加重组患者NF-κB、MMP-9蛋白相对表达量明显高于对照组，COPD急性加重组明显高于稳定期组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表4。

图1 Western blot检测SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白水平1：对照组；2：COPD稳定期组；3：COPD急性加重组

表4 三组血清SIRT1、NF-κB、MMP-9蛋白表达水平比较

与对照组比较，aP<0.05；与COPD稳定期组比较，bP<0.05

2.5 相关性分析

Pearson相关性分析显示，SIRT1 mRNA和蛋白表达水平与COPD患者FEV1、FEV1/FVC、FEV1%呈明显正相关(r=0.581、0.643、0.610，P<0.01)；SIRT1 mRNA和蛋白表达水平与NF-κB、MMP-9水平呈明显负相关(r=-0.442、0.395，P<0.01)。

3 讨 论

COPD是小气道堵塞性病变，因病情发展缓慢，患者主要为中老年人；研究认为COPD可反映肺部加速老化[5]。COPD发生、发展中体内多种炎性介质和细胞因子发挥关键作用，已成为该领域研究的热点[6]。SIRT1为沉默信息调节因子蛋白家族成员，作为高度保守的基因亚家族，可编码NAD+依赖的蛋白脱乙酰酶[7]。SIRT1通过调控多重底物蛋白间的平衡而调节细胞衰老、葡萄糖代谢等多种细胞反应[8]。研究者发现，随年龄增长血清SIRT1水平持续下降，在老年痴呆等神经系统疾病患者中血清SIRT1水平下降速度明显增加[9]；提示SIRT1可能为多种老年性疾病的潜在标志物。本研究显示，COPD稳定期和急性加重期患者血清SIRT1浓度以及外周血单核细胞SIRT1 mRNA和蛋白表达水平较对照组明显下降，且急性加重期患者下降更明显；相关性分析显示，SIRT1 mRNA和蛋白表达水平与气道阻塞指标FEV1/FVC和气道阻塞严重程度指标FEV1%均呈正相关，提示SIRT1表达水平随COPD进展逐渐下降，在病情发展中可能发挥调控作用，可作为评估病情严重程度的生物学指标。

炎症细胞因子和介质引发的慢性炎症反应是COPD发病的主要机制。研究者发现，SIRT1能够通过与不同类型的靶蛋白结合来响应胞外刺激，参与COPD的发生、发展，但具体分子机制仍未完全阐明[10]。相关研究显示，不同时期COPD患者中均存在NF-κB激活，且与病情发展密切相关[11]。本研究中COPD稳定期和急性加重期患者血清NF-κB浓度以及外周血单核细胞NF-κB mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，且急性加重期患者明显高于稳定期患者；且NF-KB与SIRT1 mRNA和蛋白表达水平呈负相关，提示SIRT1可能对NF-κB具有调控作用，SIRT1表达下调与NF-κB活性增加明显相关。

研究者发现，MMP-9在胞外基质破坏中发挥作用，与支气管哮喘、肺癌等多种疾病的发生、发展密切相关[12]。本研究显示，COPD稳定期和急性加重期患者血清MMP-9浓度以及外周血单核细胞MMP-9 mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，且急性加重期患者明显高于稳定期患者。动物实验显示，经氧化应激诱导的大鼠体内SIRT1表达下降可提升MMP-9表达水平[13]。本研究中COPD患者中MMP-9与SIRT1 mRNA和蛋白表达水平呈负相关，结合既往研究结论推测，SIRT1可能通过对NF-κB、MMP-9的调节作用来调控COPD的发生与发展，其中具体的分子机制仍需进一步深入研究。