儿童肠道病毒性脑炎的临床特点及脑脊液病毒检测结果分析

李永春，李小芹，张迎辉

作者单位：郑州大学附属儿童医院、河南省儿童医院、郑州儿童医院，a消化科,b肾病科,河南 郑州 450000

肠道病毒性脑炎(enterovirus encephalitis，EVE)多表现出头痛、发热症状，夏季为其高发季节，通常发病急[1]。EVE发病与肠道病毒(enterovirus,EV)对脑实质浸润密切相关，已知血清型超过120个，由于其发热等症状不明显，临床易误诊或漏诊，耽误病情，增加手足口病等发生风险，严重时甚至导致病儿死亡。为此早期诊断EVE至关重要。目前临床关于病毒性脑炎流行病学、病原学检测相关报道较多[2-4]，而关于病毒性脑炎类型之一的EVE病原学相关研究较少。基于此，笔者对216例EVE病儿病例资料进行回顾性分析，总结EVE临床特点及脑脊液病原学检测特点，以为临床儿童EVE诊治提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集河南省儿童医院2015年1月至2017年12月收治的EVE病儿216例，均符合《实用内科学》(13版)中EVE相关诊断标准，所有病儿病例资料完整，排除重度EVE、合并重症肺炎、自身免疫性疾病、其他系统严重感染、资料不全等病儿。男150例(69.44%)，女66例(30.56%)；年龄范围为6个月至～14岁，平均6岁，其中6个月至<3岁44例(20.37%)，3～<7岁76例(35.19%)，7～<14岁96例(44.44%)。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。病儿或近亲属对研究方案签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1标本采集 216例病儿入院后120 min内抽取其脑脊液(腰椎穿刺)2 mL、血液4 mL。常规处理后保存，若24 h内检测则保存于4 ℃冰箱内，超过24 h检测则保存于-70 ℃冰箱内。

1.2.2脑脊液病毒检测 (1)EV RNA提取，按照QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN公司)说明书对病毒核酸提取，保存于-70 ℃冰箱中；(2)实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测：试剂盒由上海江莱生物科技有限公司提供，严格依据试剂盒说明书对脑脊液标本行肠道通用型检测，若阳性再对新型肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxA16)、埃柯病毒30(ECHO30)型检测。(3)对未分型标本来说，将其接种至RD细胞，于35 ℃、5%二氧化碳环境中培养，细胞病变超过+++则对病毒收取，保存于-70 ℃冰箱中。(4)逆转录PCR(RT-PCR)、VP1区序列：(1)中提取之病毒核酸为模板，PT-PCR相关试剂盒由上海信裕生物技术有限公司提供，扩增、测序引物以文献[5]为参考；通过半巢式PCR测定VP1区序列，如引物AN32，其序列为5’-GTYTGCCA-3’，用于PT；AN224序列为5’-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3’,用于PCR-1，扩增产妇993 bp；AN89序列为5’-CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG-3’，用于PCR-2，扩增产物37 6bp；(5)PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。(6)核苷酸测序。

1.2.3脑脊液IgM抗体检测 通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定脑脊液特异性IgM抗体，相关试剂盒由上海瓦兰生物科技有限公司提供。酶标仪对波长450 nm处吸光度(A)测定，标本A值在1.1倍临界值及以上判断为阳性，在0.9倍临界值及以下判断为阴性，临界值±10%内判断为可疑，重复测定。

1.2.4资料收集 对216例EVE病儿病例资料收集整理，包括EVE症状、实验室检查[如白细胞(WBC)、C反应蛋白(CRP)、肝功能指标、心肌酶指标]、脑电图检查、病原学检测、治疗、预后等。

1.3 统计学方法应用SPSS20.0统计软件处理数据。计数资料以率表示，行χ2检验。多组间比较检验水准α=0.05，,两两比较α=0.017。

2 结果

2.1 临床特点

2.1.1临床症状 216例病儿中出现发热症状150例(其中高热50例，中热78例，低热22例)，头痛139例，呕吐162例，表现出抽搐2例，有可疑脑膜刺激征或病理征3例，少数表现出腹痛、腹泻、咳嗽症状，大部分无明显流涕、流泪等症状。均无意识障碍、呼吸困难等严重症状发生。不同年龄段病儿主要症状见表1。

表1 不同年龄段EVE病儿主要症状/例(%)

注：“—”表示因病儿主诉不清未统计;EVE为肠道病毒性脑炎

2.1.2发病时间段 3—5月30例(13.89%)，6—8月85例(39.35%)，9—11月68例(31.48%)，1、2、12月33例(15.28%)。

2.1.3相关检查 WBC总数超过10×109/L者149例(68.98%)，WBC总数下降者2例(0.92%)；CRP上升者125例(57.87%)；肝功能异常者40例(18.52%)，均未发生黄疸；心肌酶检查异常者172例(79.63%)。所有病儿均接受脑电图检查，显示轻中度异常47例(21.76%)；颅脑CT平扫者180例，均未发现显著异常。

2.2 脑脊液病原学检测

2.2.1脑脊液EV检测结果 216份脑脊液标本EV通用核酸检测阳性120份，其中ECHO30核酸阳性95份(79.17%，95/120)，CoxA16核酸阳性5份(4.17%，5/120)，EV71核酸阳性5份(4.17%，5/120)，未分型15份(12.50%，15/120)。不同年龄段病儿脑脊液EV通用核酸阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=25.38，P<0.05)，6个月至<3岁与3～<7岁之间EV通用核酸阳性率比较差异无统计学意义(χ2=3.01，P>0.017)，6个月至<3岁与7～<14岁、3～<7岁与7～<14岁之间比较差异有统计学意义(χ2=21.34、12.35，P均<0.017)，见表2。同时不同发病季节病儿脑脊液EV通用核酸阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=111.37，P<0.05)，3—5月与6—8月、3—5月与9—11月EV通用核酸阳性率比较差异有统计学意义(χ2=58.72、48.87，P<0.017)，6—8月与9—11月之间比较差异无统计学意义(χ2=0.28，P>0.017)，1、2、12月与6—8月、1、2、12月与9—11月之间比较差异有统计学意义(χ2=62.30、52.01，P<0.017)，见表3。

表2 不同年龄段EVE病儿脑脊液EV通用核酸阳性情况

表3 不同发病时间段EVE病儿脑脊液EV通用核酸阳性情况

2.2.2脑脊液IgM抗体检测结果 216例病儿中脑脊液特异性IgM抗体阳性95例。不同年龄段病儿脑脊液特异性IgM抗体阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=16.91，P<0.05)；6个月至<3岁与3～<7岁、6个月至<3岁与7～<14岁之间IgM抗体阳性率比较差异有统计学意义((χ2=5.50、16.80，均P<0.017)，3～<7岁与7～<14岁之间比较差异无统计学意义(χ2=3.95，P=0.047)，见表4。不同发病时间段病儿脑脊液特异性IgM抗体阳性检出率比较差异有统计学意义(χ2=69.83，P<0.05)；3—5月与6—8月、3—5月与9—11月IgM抗体阳性率比较差异有统计学意义(χ2=34.70、32.43，P<0.017)，6—8月与9—11月之间比较差异无统计学意义(χ2=0.01，P>0.017)，1、2、12月与6—8月、1、2、12月与9—11月之间比较差异有统计学意义(χ2=37.35、34.89，P<0.017)，见表5。

表4 不同年龄段EVE病儿脑脊液特异性IgM抗体阳性情况

表5 不同发病时间段EVE病儿脑脊液特异性IgM抗体阳性情况

2.3 治疗与预后所有病儿入院后接受抗病毒、20%甘露醇静注、支持等综合治疗，且根据相关检查结果对症处理，如WBC、CRP显著上升者给予抗生素处理，高热者给予物理降温等处理。所有病儿经综合治疗后好转，均治愈出院。

3 讨论

于盼辉等[6]调查显示病毒性脑炎病毒阳性检出率41.50%，其中EV占87.88%。但EV与其他病毒引发病毒性脑炎病儿在性别、临床表现、脑电图、MRI检查方面均无明显差异。田茂强等[7]调查发现儿童病毒性脑炎病原学方面，EV占72.00%。根据病毒性脑炎病原学流行特点，我们选择EVE为研究对象，探讨其EVE临床特点及脑脊液病毒检测特点。

3.1 EVE儿童临床特点本研究显示EVE主要表现发热、头痛、呕吐等症状，与病毒性脑炎症状基本类似[8]。仅3例表现出可疑脑膜刺激征或病理征，抽搐2例。进一步观察不同年龄病儿临床症状，发现3～<7岁病儿发热症状比率最高，其次是呕吐，第三是头痛；<7～<14岁病儿头痛症状比率最高，其次是呕吐，第三是发热。同时2例抽搐均发生于<3岁病儿。可见不同年龄段EVE临床症状存在一定的不同，但整体上无明显差异。发病时间段方面，我们发现6—11月发生153例(70.83%)，特别是6—8月，EVE发生率占39.35%。可见EVE好发于夏秋季，特别是夏季。这是因为EV在黏液、唾液、排泄物中分布，经由接触传播，同时EV有耐热、耐酸性，因此夏季EVE发病率高[9]。相关检查指标方面，WBC、CRP在临床上常用于感染判断，本研究显示WBC总数>10×109/L占68.98%，CRP升高占57.87%，与EVE病儿表现出发热症状保持一致。还发现肝功能异常率18.52%，心肌酶异常占79.63%。提示EVE可能引发心肌炎等相关疾病，需高度重视EVE。本研究发现EVE伴轻中度脑电图异常，但通常不存在脑实质改变征象。此外，目前临床尚无特异方案干预儿童EVE，病儿虽表现出发热、呕吐等症状，但及时给予抗病毒等综合治疗后，病儿预后通常较好。

3.2 EVE儿童脑脊液病毒检测EV为脑炎发生常见病原体之一，主要包括ECHO病毒、COX病毒、新型肠道病毒等，其中ECHO病毒全球流行，是EVE发生的主要肠道病毒；CoxA16、EV71感染引发脑炎在高原地区等也有所报道，EV全球各地均有所分布，易引发流行性疾病，对机体多系统可以影响，临床症状多样，严重时甚至威胁病人性命，且EV引发疾病以儿童多见。目前临床常通过症状、辅助检查、脑脊液病原学检测等综合判断病毒性脑炎。其中脑脊液病原学检测有ELISA、病毒核酸检测等。Real-Time PCR为病毒核酸检测重要手段，对微量特异性核酸序列可快速检测，且准确度高[10]。本研究通过Real-Time PCR检测EV核酸，结果显示脑脊液EV通用核酸检测阳性率55.56%，其中ECHO30核酸阳性最多，占79.17%，与相关报道[11]结果相符。ECHO30感染会导致儿童无菌性脑膜炎流行[12-13]。同时本研究CoxA16与EV71检出率均为4.17%，而未分型检出率12.50%。可见EV类型多样，其中以ECHO30最为常见。

ELISA具有操作简单、特异度强等特点，我们通过ELISA法测定脑脊液特异性IgM抗体，结果显示IgM抗体阳性率43.98%，比EV通用核酸检测阳性率低，这可能与抗体产生与病儿免疫功能、病程相关，有个体差异性有关[14]。卢囡囡等[15]研究显示5～10岁儿童EVE发生率较高，占EV通用核酸阳性的81.82%。本研究EVE病儿年龄7～<14岁96例，<3岁44例，但<3岁病儿脑脊液EV通用核酸阳性检出率最高，与卢囡囡等[15]研究结果不相符，这可能与不同地区高度、气候条件、环境等不同有关。本研究还显示脑脊液EV通用核酸阳性检出率、特异性IgM抗体阳性检出率与EVE病儿年龄、发病时间段有关，6个月至<3岁病儿示脑脊液EV通用核酸阳性检出率、特异性IgM抗体阳性检出率最高，这可能与<3岁病儿机体免疫系统发育不成熟、机体抵抗能力差等有关，同时也可反映出脑脊液EV通用核酸阳性检出率与特异性IgM抗体阳性检出率在年龄分布、发病时间段上有一致性，这与EVE发病特点(好发于夏季等)有关。但<3岁脑脊液EV通用核酸阳性、特异性IgM抗体阳性构成比相比其他年龄段无显著差异，这与本研究病例选择有关。

综上，儿童EVE主要表现出发热、头痛、呕吐等症状，以夏、秋季为发病高峰季节；ECHO30为EVE脑脊液病毒主要类型，特异性IgM抗体检出率较高。由于目前关于EVE流行病学调查较少，且本研究为回顾性分析，样本例数较少，关于EVE流行病学、病原学研究需日后通过大样本进一步分析。