基于中药整合药理学计算平台的小柴胡汤抗脓毒症的分子机制研究Δ

杨清鑫，吕红君，王小博，任劲松，曾南#（.成都中医药大学药学院药理教研室，成都637；.四川中医药高等专科学校药学院，四川绵阳 6000）

脓毒症（Sepsis）是机体对感染的反应失调而引起的器官功能障碍[1]，其早期表现为高炎症反应状态，但应用抗细胞因子和抗炎症介质的治疗在临床上基本无效[2]。研究表明，脓毒症在发生过程中促炎反应与抗炎反应同时存在，即机体在发生炎症反应综合征（SIRS）同时存在代偿性抗炎反应综合征（CARS）[3]，二者之间失衡导致的免疫紊乱可能是脓毒症的主要致病机制。脓毒症的发病率、病死率高[2]，亟需重视，故寻求新的治疗方法势在必行，调节免疫可能是其新的治疗方向[3]。现代药理学研究表明，小柴胡汤具有抗炎和增强人体免疫功能的作用，特别是对机体免疫反应具有双向调节性[4]，这为治疗脓毒症提供了一个新的契机。小柴胡汤方出自东汉张仲景的《伤寒论》，由柴胡、黄芩、人参、半夏、（炙）甘草、生姜、大枣7味药材组成，用于治疗伤寒少阳证。该方组方精良、配伍严谨，在长期的医疗实践中，被广泛应用于肝胆、消化、内分泌、血液、免疫等系统疾病的治疗[5-6]。

中药复方常用于中医临床治疗中，但其物质基础与机体活动以及疾病靶标之间的关系尚不明确，仍然是亟待突破的关键科学问题，应从多层次、多环节对中药复方与机体的相互作用关系进行系统解析。整合药理学作为中药现代化研究的新方法，为传统方剂的现代研究与应用提供了新的思路。中药复方的现代研究，需要加强整合，包括整体与局部的整合，宏观与微观的整合，体内 ADME（Absorption，distribution，metabolism，excretion）过程与活性评价的整合，计算与实验的整合，也就是进行整合药理学研究[7]。借助相关整合药理学的平台，可构建小柴胡汤的“多成分-潜在作用靶标-疾病靶标-相互作用网络”的多维网络关联性联系，为其后续的开发提供参考。

1 资料与方法

1.1 资料来源

中药整合药理学计算平台[TCMIP，网址：http：//www.tcmip.cn/，共有4大数据库，包括中药方剂数据库、中药材数据库、中药成分数据库、疾病/症状靶标数据库；其中中药方剂数据库依据《中华人民共和国卫生部药品标准-中药成方制剂》，收录了由中医传承辅助系统整理的4 052种中成药，主要记载方剂名称、剂型、服用方法、方剂功效、治疗中医疾病名称、方剂组成（包括药材名称、用量、方剂地位）等信息；中药材数据库依据2015年版《中国药典》，收录了400余味常用中药材，包括每一味药材的中文名称、拉丁名称、性味归经、基原、产地、采集期、功效等信息；中药成分数据库收录了中药材数据库中中药材所含的1.3万余个化学成分信息，包括成分名称、CAS号、中文名称、英文名称、分子式、相对分子质量、理化性质、药物代谢性质、药理作用等；疾病/症状靶标数据库整合了Drugbank（https：//www.drugbank.ca/）、OMIM（http：//www.omin.org/）、HPO（http：//human-phenotype-ontology.github.io/）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、京都基因与基因组百科全书（KEGG，http：//www.kegg.jp/）、基因本体（GO）数据库（http：//www.geneontology.org）等数据库资源，提供治疗疾病或症状的药物名称、药物疗效和临床应用，以及药物靶标的基因和蛋白质相关信息，并可按照疾病或者症状关键词进行检索] 由北京大品种联盟科技咨询有限公司搭建。

1.2 化学成分的搜集

在TCMIP中建立任务列表，在“中药信息”项中添加“半夏”“柴胡”“大枣”“甘草”“黄芩”“人参”“生姜”7 味药材，搜集中药成分数据库中收载的相关化学成分，建立小柴胡汤的化学成分数据库。

1.3 候选靶标的搜集

进入TCMIP，在“疾病靶标信息”项中，输入脓毒症的英文“Sepsis”作为关键词进行检索，在疾病/症状靶标数据库中收集脓毒症的已知治疗靶标。所得结果作为小柴胡汤候选靶标来源。

1.4 共有靶标的预测

进入TCMIP，然后在“中药靶标预测”界面选取相似性分数≥0.8的所有靶标作为小柴胡汤的潜在靶标。TCMIP可采用二维结构进行相似性搜索，并采用Tanimoto系数定义的相似度计量方法，通过与美国FDA批准的所有药物进行化学结构（“1.2”项筛选出的）相似性比对，进行小柴胡汤中半夏、柴胡、大枣、甘草、黄芩、人参、生姜7味药材的共有靶标预测，并进行共有靶标分析[8-9] 。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用的网络建立

在TCMIP上进行“1.2”和“1.3”项下操作后可直接获得小柴胡汤治疗脓毒症的候选靶标与脓毒症靶标之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）信息。TCMIP主要整合了 Reactome、HAPPI、HPRD、OPHID、InAct、PDZBase、MINT、DIP等数据库中的PPI[10]。此步骤可获取小柴胡汤作用候选靶标与脓毒症靶标之间的互作关系，进一步通过TCMIP的网络分析模块，计算小柴胡汤作用的候选靶标与脓毒症靶标之间互作关系的网络特征数据。

1.6 小柴胡汤的“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”的多维网络的构建

利用String数据库进行蛋白质之间及与预测蛋白质之间相互作用的搜索。将小柴胡汤的蛋白靶标导入String数据库，限定物种为“人”，获取小柴胡汤抗脓毒症的潜在靶标间的相互关系。利用Cytoscape软件，绘制PPI网路，用Cytoscape的工具Network Analyzer进行网络分析，设置节点大小和颜色用于反映Degree（连接度，即在网络中通过该点的边的个数）值的大小，设置边的粗细用于反映结合分数的大小，并进行GO功能、KEGG通路富集分析，构建“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”多维网络[11]。

1.7 基因功能和通路富集分析

在TCMIP的信息设定页面，添加中药“半夏”“柴胡”“大枣”“甘草”“黄芩”“人参”“生姜”，以上述 7 味药作为分析对象，进行药物靶标预测，选择相似性分数≥0.8的成分靶标作为候选靶标，共277个。将上述靶标导入DAVID 6.7，基于KEGG和GO数据库分别对上述277个靶标进行通路富集和基因功能分析。

2 结果

2.1 小柴胡汤化学成分与候选靶标来源预测及分析

通过TCMIP，收集得到小柴胡汤所含7味中药共647个化学成分，其中半夏41个、柴胡62个、大枣72个、甘草133个、黄芩54个、人参158个、生姜127个。小柴胡汤共有5 368个“成分-靶标”信息，其中半夏、柴胡、大枣、甘草、黄芩、人参、生姜的候选靶标数量分别为241、748、1 212、360、537、2 013、257个。

2.2 小柴胡汤共有靶标预测及分析

通过分析单味中药两两之间的共有靶标，得到小柴胡汤中单味中药间的共有靶标，见表1。

表1 小柴胡汤中单味中药间共有靶标分析Tab 1 Common targets of single herbs in Xiaochaihu decoction

由表1可见，7味中药之间均有不同数目的共有靶标，说明彼此之间存在某些协同或拮抗作用；其中人参与其他6味中药之间共有靶标最多，暗示佐药人参能够协助君药（柴胡）和臣药（黄芩）发挥较强的协同作用。

2.3 小柴胡汤抗脓毒症的PPI网络的构建

筛选出小柴胡汤抗脓毒症的候选靶标277个、直接靶标6个、通用靶标1个。直接靶标包括血小板因子（PF）4、髓样分化因子（MYD）88、Toll样家族受体（TLR）4、CD14、一氧化氮合酶（NOS）3等。小柴胡汤抗脓毒症的候选靶标网络见图1。

图1 小柴胡汤抗脓毒症的候选靶标网络Fig 1 The candidate target network of Xiaochaihu decoction for sepsis

2.4 小柴胡汤抗脓毒症的“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”的多维网络分析

为将小柴胡汤抗脓毒症的复杂作用机制以网络的形式具体表现出来，TCMIP生成的小柴胡汤抗脓毒症的“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”多维网络关系图，见图2。

由图2可见，小柴胡汤抗脓毒症的作用主要与224个化学成分相关联，作用于30条主要作用通路的118个核心靶标，这是该方发挥抗脓毒症药效的核心所在，也体现了多成分与多靶点之间共同作用的机制，符合中药复方作用的特点。

2.5 小柴胡汤候选靶标的基因功能及通路富集分析

对小柴胡汤候选靶标进行GO基因功能分析，取P值越小的前20排名得到候选靶标具有的功能信息，发现小柴胡汤涉及的基因功能多与线粒体有氧呼吸过程相关，线粒体不仅是细胞能量的代谢中心，而且是细胞命运调控的信号枢纽[12]，提示小柴胡汤对于能量代谢障碍相关的疾病具有调控作用；对小柴胡汤20个候选靶标进行KEGG通路富集分析，取P排名前20得到候选靶标参与的通路信息，发现其主要作用于能量代谢、氨基酸代谢和糖代谢。小柴胡汤20个候选靶标具有的基因功能信息见表2，小柴胡汤20个候选靶标参与的通路信息见表3（表中的“条目”只列出英文，中文略）。

图2 小柴胡汤抗脓毒症的“中药-化学成分-核心靶标-关键通路”多维网络关系Fig 2 The multidimensional network relationship of“TCM-chemicalcomponent-core targets-key pathways”of Xiaochaihu decoction for sepsis

表2 小柴胡汤抗脓毒症20个候选靶标具有的基因功能信息Tab 2 The gene function information of 20 candidate targets of Xiaochaihu decoction for sepsis

表3 小柴胡汤抗脓毒症20个候选靶标参与的通路信息Tab 3 The pathway information of 20 candidate targets of Xiaochaihu decoction for sepsis

2.6 小柴胡汤抗脓毒症的关键靶标基因功能及通路富集分析

通过富集分析，针对小柴胡汤的关键潜在靶标，将P排名前20的通路显示出来。结果发现其基因功能涉及胞质溶胶、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）结合、线粒体、线粒体基质、线粒体内膜、胞外体、蛋白激酶活性、辅酶Ⅰ结合、三羧酸结合、蛋白结合、酶结合等多个与能量代谢相关的条目，推测脓毒症可能与人体能量代谢有较大关联。根据P值越小的前20排名得到小柴胡汤抗脓毒症的KEGG通路，结果显示，其主要作用通路有嘌呤代谢、核苷酸代谢、碳代谢、丙酮酸盐代谢、氨基酸代谢等多条代谢途径以及内分泌系统、雌激素受体信号转导通路、内分泌和代谢性疾病、趋化因子信号通路、促性腺激素释放激素信号转导通路、神经系统等。小柴胡汤抗脓毒症20个关键靶标的基因功能信息见表4，KEGG通路富集分析结果见表5（表中的“条目”只列出英文，中文略）。

3 讨论

3.1 小柴胡汤抗脓毒症的理论依据

小柴胡汤为汉代张仲景所创，疗效肯定，应用广泛，被历代奉为经典，目前仍是临床使用概率最高的方剂之一。该方是治疗少阳证的经典名方，少阳证的主要症状为往来寒热，而发热亦是脓毒症的主要临床症状，故利用该方治疗脓毒症具有一定的依据。文献记载，在小柴胡汤主治病症中，以发热最多[13]。有文献调查了1984－2002年间关于小柴胡汤治疗发热的报道[14]，显示小柴胡汤所治疗的发热以高热居多，适合疾病种类广泛，其中感染性发热较多，同时对非感染性发热（包括癌性发热、免疫系统等引起的发热）和不明原因发热亦有效。实验研究[15]也表明，小柴胡汤可明显降低肺炎链球菌感染模型动物死亡的发生率及内毒素致发热模型动物各时间段体温的升高水平。此外，少阳证多由免疫功能失调所致，而免疫功能失调也是脓毒症的主要致病机制之一[16]，表明小柴胡汤抗脓毒症也具有一定的理论依据。

表4 小柴胡汤抗脓毒症20个关键靶标具有的基因功能信息Tab 4 The gene function information of 20 key targets of Xiaochaihu decoction for sepsis

表5 小柴胡汤抗脓毒症20个关键靶标所参与的通路信息Tab 5 The pathway information of 20 key targets of Xiaochaihu decoction for sepsis

3.2 小柴胡汤抗脓毒症的靶点预测

目前小柴胡汤抗脓毒症的应用效果尚未被发现，而且其活性成分和作用机制的研究亦较为匮乏。本文借助整合药理学方法，从多成分、多靶标角度揭示该方抗脓毒症的潜在分子机制，为其临床开发提供参考。结果表明，小柴胡汤抗脓毒症主要与224个化学成分相关，其活性成分可针对多个靶点、多条通路发挥抗脓毒症的作用，作用可能与神经系统、嘌呤代谢、核苷酸代谢等代谢相关通路，T细胞信号通路、趋化因子信号通路、FcεRI信号通路等炎症相关通路，促性腺激素释放激素信号通路、雌激素受体信号传导通路、催乳激素信号通路、催产素信号通路等与内分泌系统相关的通路及循环系统有关，上述靶点及通路与文献报道[17]中的脓毒症的发病机制研究具有一定的吻合性，涉及到脓毒症发病机制的各个环节，同时表明TCMIP在预测中药及复方作用机制方面具有较高的准确性。综上，本研究基于TCMIP进行预测，发现小柴胡汤抗脓毒症作用的发挥可能与调控神经系统、内分泌系统、免疫系统及各种代谢等密切相关，即其可从“神经-内分泌-免疫-代谢”等多个层面、多种途径来干预脓毒症，研究结果可为小柴胡汤抗脓毒症的相关研究提供一定参考，但该方抗脓毒症的作用机制研究以及临床开发仍需通过进一步的实验研究进行验证。此外，预测结果提示小柴胡汤在乙型肝炎、非酒精性脂肪肝、阿尔茨海默病等疾病治疗中存在一定的应用价值，与其现有的一些临床应用相关，且为小柴胡汤的后续研究与开发提供了借鉴。

3.3 小柴胡汤各单味中药抗脓毒症的分析

现代药理研究亦提示，小柴胡汤中的各味中药具有一定抗脓毒症作用，其中柴胡的主要化学成分包括皂苷类、挥发油类、黄酮类、糖类、香豆素类等，柴胡皂苷、挥发油是柴胡的主要活性成分，具有良好的抗炎作用，柴胡多糖通过对骨髓间充质细胞（BMCs）的免疫再分布的影响作用，能有效恢复脓毒症晚期的免疫平衡，具有很好的免疫调节作用[18]。黄芩具有清热燥湿、泻火解毒等功效，临床上广泛用于多种急性感染性疾病[19]；黄芩中含有黄酮类化合物、挥发油及多糖等各种成分，且具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏[20]、抗内毒素等药理作用，黄芩苷是黄芩抗内毒素作用的有效成分之一[21]。脓毒症属中医“血证”范畴，病机多为气阴两虚、阳脱阴竭，故治疗以补气固脱为主。人参大补元气，对人体有滋补强壮作用[22]；人参中含有人参皂苷、多糖等多种化学成分，人参多糖作为人参发挥药效的活性成分，具有明显的增强免疫的作用；人参多糖主要通过阻止特异性免疫细胞凋亡和提高机体免疫防御来治疗脓毒症[23]；人参皂苷中的人参皂苷Rg5和人参二醇型皂苷（PDS）可改善脓毒症损伤[22]。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功效，主要化学成分有三萜类、黄酮类、生物碱类及多糖类[24]；其三萜类成分甘草甜素作为高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的抑制剂，可在脓毒症模型小鼠中发挥有效作用[25]。甘草多糖对小鼠机体免疫有增强作用[26]。大枣含有大量成分复杂的糖类物质，大枣多糖具有增强免疫的作用[27]。生姜醇提物具有显著的抗肿瘤作用和免疫调节活性[28]。中医学认为脓毒症的病机还包括气机紊乱，临床常采用调气和胃来治疗脓毒症，半夏苦辛燥，具有散结除痞、降逆和胃的功效，故半夏在脓毒症的治疗上也具有较好的开发前景[29]。

3.4 小柴胡汤抗脓毒症的作用机制

脓毒症的发病机制较为复杂，包括炎症感染、免疫失调、凝血功能活化、代谢紊乱、神经-内分泌系统-免疫调节系统失调等，涉及机体的多系统、多器官的病理改变[30]。研究表明发生脓毒症时，血小板作为炎症反应、凝血激活和血栓形成的核心因素，其参与到脓毒症的各个环节。PF4作为血小板活化的标记物及活化后释放的含量最丰富的活性因子之一[31]，会通过正反馈加强炎症反应，并促进炎症介质的大量释放，同时，炎症介质又加重炎症反应，最终引起多器官功能障碍综合征[32]。研究发现TLRs介导的信号传导通路与脓毒症的发病有关，TLRs通过识别病原相关分子模式与细胞外受体结合启动炎症信号通路的激活[33]，TLR4是革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）信号转导的主要受体，TLR4介导的信号转导通路是脓毒症中炎性因子产生的重要途径。研究表明，LPS首先与LPS结合蛋白（Lipopolysaccharide bindingprotein，LBP）结合，再传递给CD14分子，形成LPS/LBP/CD14复合物，然后与TLR4/MD2相互作用[34]，TLR4被激活后通过MyD88依赖型信号转导途径和MyD88非依赖型信号通路引起炎性细胞因子的高表达，并激活核转录因子κB（NF-κB），从而促进各种炎症介质大量分泌释放，如白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8等，导致脓毒症的进一步加重[35]。其中共有靶标是缓激肽B2受体（BDKRB2），其作为G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）超家族成员，缓激肽（BK）可通过B2受体活化磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路[36]，而PI3K/AKT通路在炎症反应过程中发挥重要作用，发生脓毒症时PI3K/AKT活化并激活其下游的NLRP3炎性小体，使其释放量明显增加，从而加重机体的炎症反应[37]。本研究涉及的通路包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解等氨基酸代谢通路，碳水化合物代谢、碳代谢、糖酵解/糖异生、丙酸代谢、丙酮酸盐代谢、柠檬酸循环等糖代谢通路。脓毒症早期处于呼吸加快，ATP生成增加、激素分泌增多的高代谢状态，后期表现为ATP生成减少和激素分泌下调、代谢率降低、线粒体功能出现紊乱的状态，且研究发现线粒体利用氧的能力降低是脓毒症发病的关键[38]；亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸作为重要的生糖氨基酸都可以调节血糖水平，为机体活动提供能量，脓毒症患者中高血糖问题普遍存在，血糖的高低不仅反映病情严重程度，也与病情预后关系密切。脓毒症发生时，巨噬细胞的有氧糖酵解为巨噬细胞快速释放大量炎症介质和细胞因子提供能量，并促进乳酸的进一步聚集，这是介导巨噬细胞免疫功能过度激活的关键机制。由此，推测小柴胡汤是通过影响线粒体活动，影响机体能量代谢，保证线粒体有氧呼吸过程的正常进行，从而缓解脓毒症引起的微循环障碍及多器官功能衰竭；以及调节机体氨基酸代谢和糖代谢的紊乱，降低脓毒症患者的病死率及改善预后。

此外文献研究[39]表明，脓毒症发生时，因患者激素分泌呈昼夜节律性改变，继而内分泌代谢发生变化，脓毒症时过度炎症反应可抑制促肾上腺皮质激素（Adreno-cortico-tropic-hormone，ACTH）对肾上腺皮质醇的促分泌作用，引起“相对性肾上腺皮质功能不全”，最终导致组织损伤和器官功能障碍[39]。已有文献报道[40]表明，小柴胡汤对内分泌具有显著调节作用，具有类似激素的作用，能促进垂体-肾上腺-皮质功能，增加糖皮质激素的分泌及其与受体的结合，发挥间接的抗炎作用。而且，小柴胡汤对促肾上腺皮质激素（ATCH）的分泌具有双向调节作用，不仅能促进ATCH的分泌，也会抑制ATCH的分泌。由此推测小柴胡汤抗脓毒症可能与代谢、内分泌系统密切相关。亦可见小柴胡汤抗脓毒症是从多层面协同发挥作用，具有多靶点性，符合中医学的整体观。

总之，小柴胡汤抗脓毒症的相关通路涉及神经系统、内分泌系统、细胞生长与死亡、循环系统等多个方面，主要包括促性腺激素释放激素信号通路、雌激素受体信号传导通路、催乳激素信号通路、催产素信号通路等与内分泌系统相关的通路；以及T细胞信号通路、趋化因子信号通路、FcεRI信号通路等炎症相关通路，以及嘌呤代谢、核苷酸代谢等代谢相关通路；以及血管内皮细胞生长因子信号通路等循环系统相关通路；以及内分泌和代谢性疾病、神经退行性疾病、前列腺癌、乙型肝炎等疾病相关通路。不同化学成分的作用靶点分布于不同的信号通路，相互协调，再次表明小柴胡汤抗脓毒症的作用发挥与调控内分泌系统、免疫系统、代谢密切相关，小柴胡汤可以从“神经-内分泌-免疫-代谢”等多层面、多途径、多通路来干预脓毒症。