参黄搽剂的质量标准研究Δ

江洁怡，李素梅，胥爱丽，李养学（广东省中医药工程技术研究院/广东省中医药研究开发重点实验室，广州510095）

参黄搽剂为本院院内制剂，由苦参、黄柏、大黄、黄芩、冰片五味中药经水煎浓缩后制备而成，具有清热燥湿、解毒止痒等作用，用于治疗皮炎、接触性皮炎、痤疮及毛囊炎等病，症见皮肤红肿、瘙痒渗液，症属湿热毒蕴者均适用。作为方中君药，苦参具有多种药理活性，如抗病原微生物、抗炎、抗过敏、调节免疫和神经等[1]，而苦参碱和氧化苦参碱作为苦参中的主要药效成分，具有抗过敏[2]、抑菌[3-4]、抗病毒[5-6]、抗炎[7]、抗心律失常[8]、抗肿瘤[9]、抗纤维化[10]等作用。黄柏具有降血压、抑菌、抗癌等药理活性[11]，大黄具有泻下、止血、抗炎、抗氧化等药理活性[12]，黄芩具有抑菌、抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎等药理活性[13-14]，以上三药共为臣药，共同发挥增强君药清热解毒、燥湿的作用。冰片为使药，具有抑菌、消炎镇痛等药理活性，且冰片作为常用的佐使药，与其他药味配伍时，能起到提高药物生物利用度的作用[15-16]。本制剂在临床应用多年，疗效确切，但其质量标准较低。现有质量标准仅对苦参、大黄两味药材进行薄层鉴别[17]，为了有效地控制该制剂质量，确保临床用药的安全性和有效性，本研究拟采用薄层鉴别法（TLC）对该制剂中苦参、黄柏、大黄、黄芩四味药材进行定性鉴别，同时采用高效液相色谱法（HPLC）测定方中苦参碱和氧化苦参碱的含量，为其质量标准的制订提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260型HPLC仪（美国Agilent公司）；TLC SAMPLER 4型自动点样仪、Reprostar 3薄层成像系统（瑞士Camag公司）；XS205 DU型电子分析天平（美国Mettler-Toledo公司）；HWS-26型电热恒温水浴锅（重庆金控科技有限公司）；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；Micro 17R型微量离心机（美国Thermo公司）；KQ-700DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-QAdvantage型A10自动纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

参黄搽剂（由广东省中医药工程技术研究院提供，批号：180604、180605、180606，规格：每瓶装30 mL，每1 mL含生药82 mg）；苦参对照药材（批号：121019-201708）、黄柏对照药材（批号：121510-201105）、大黄对照药材（批号：120984-201202）、黄芩对照药材（批号：120955-201309）、苦参碱对照品（批号：110805-201709，纯度：98.7%）、大黄酸对照品（批号：110757-201607，纯度：99.3%）、氧化苦参碱对照品（批号：110780-201508，纯度：92.5%）均购自中国食品药品检定研究院；硅胶G薄层板、硅胶H薄层板（青岛海洋化工厂）；乙腈等液相用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 苦参、黄柏、大黄、黄芩的定性鉴别

2.1.1 苦参 取参黄搽剂25 mL，加浓氨水调pH为8～9，然后用三氯甲烷萃取2次，每次30 mL；取萃取后的三氯甲烷液，蒸干后残渣加三氯甲烷1 mL溶解，作为供试品溶液。另取苦参对照药材0.5 g，加水150 mL，加热微沸提取1 h，滤过并浓缩至约25 mL，加浓氨水调溶液pH为8～9，然后照供试品溶液处理法制成对照药材溶液。另取苦参碱对照品适量，加乙醇制成质量浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。按处方工艺制备缺苦参的阴性样品，同供试品溶液处理方法制成缺苦参的阴性对照溶液。照2015年版《中国药典》（后文简称“药典”）（四部）通则0502[18]中TLC法进行测定，吸取上述制备好的4种溶液各10µL，分别点于同一用1%NaOH溶液制备的硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-甲醇（8∶3∶0.5，V/V/V）为展开剂，展开，取出晾干后，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶2∶1，V/V/V/V，10℃以下放置）上层溶液为展开剂，展开，取出晾干，用碘化铋钾试液显色。结果，在供试品色谱图上，在与对照药材/对照品图谱相同位置上有对应斑点出现，且阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 苦参的TLC图Fig 1 TLC chromatograms of S.flavescens

2.1.2 黄柏 取黄柏对照药材0.1 g，加水约150 mL，加热微沸提取1 h，滤过并浓缩至约25 mL，加浓氨水调溶液pH至8～9，同“2.1.1”项下供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方工艺制备缺黄柏的阴性样品，同“2.1.1”项下供试品溶液制备方法制成缺黄柏的阴性对照溶液。照药典（四部）通则0502[18]中TLC法进行测定，吸取已制备好的2种溶液和“2.1.1”项下的供试品溶液各5µL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂制备的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（30∶15∶4，V/V/V，10℃以下放置）下层溶液作为展开剂，置于以氨气熏蒸预饱和的展缸中，展开，取出晾干，置于紫外光灯（波长为365 nm）下检视。结果，在供试品色谱图上，在与对照药材图谱相同位置上有对应斑点出现，且阴性对照无干扰，结果见图2。

2.1.3 大黄 取参黄搽剂15 mL，加盐酸1 mL，水浴回流30 min，立即冷却，用乙醚萃取2次，每次20 mL；取萃取后的乙醚溶液，蒸干后加三氯甲烷1 mL溶解，得供试品溶液。另取大黄对照药材0.3 g，加水150 mL，加热微沸提取1 h，滤过并浓缩至约15 mL，再加盐酸1 mL，然后按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。另取大黄酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。按处方工艺制备缺大黄的阴性样品，然后按供试品溶液制备方法制成缺大黄的阴性对照溶液。照药典（四部）通则0502[18]中TLC法进行测定，吸取制备好的供试品溶液、阴性对照溶液各8µL，对照药材溶液、对照品溶液各4µL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为黏合剂制备的硅胶H薄层板上，用石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上层溶液作为展开剂，展开，取出晾干后，置于氨气中熏至斑点清晰，于紫外光灯（波长为365 nm）下检视。结果，在供试品色谱图上，在与对照药材图谱相同位置上有对应斑点出现，且阴性对照无干扰，结果见图3。

图2 黄柏的TLC图Fig 2 TLC chromatograms of P.chinense

图3 大黄的TLC图Fig 3 TLC chromatograms of Rhei Radix Et Rhizoma

2.1.4 黄芩 取参黄搽剂20 mL，蒸至近干，加硅藻土适量吸附，蒸干，加乙酸乙酯20 mL，超声（功率：700 W，频率：40 kHz）提取30 min，滤过，蒸干后残渣加甲醇2 mL溶解，得供试品溶液。另取黄芩对照药材1 g，加水150 mL，加热微沸提取1 h，滤过并蒸至近干，加硅藻土适量吸附，蒸干，然后按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方工艺制备缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制成缺黄芩的阴性对照溶液。照药典（四部）通则0502[18]中TLC法进行测定，吸取制备好的3种溶液各2µL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2，V/V/V/V）混合溶液为展开剂，置于展缸中预饱和30 min，取出晾干，于紫外光灯（波长为365 nm）下检视。结果，供试品色谱图上，在与对照药材图谱相同位置上有对应斑点出现，且阴性对照无干扰，结果见图4。

图4 黄芩的TLC图Fig 4 TLC chromatograms of S.baicalensis

2.2 苦参碱、氧化苦参碱的含量测定

2.2.1色谱条件色谱柱：Phenomenex Luna NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸水溶液（80∶10∶10，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：45 ℃；进样量：5 μL。

2.2.2 溶液的制备 （1）混合对照品溶液：分别精密称取苦参碱、氧化苦参碱对照品适量，用无水乙醇-乙腈（20∶80，V/V）溶液溶解，并制成苦参碱、氧化苦参碱质量浓度分别为407.20、420.15 μg/mL的单一贮备液，备用。分别取苦参碱、氧化苦参碱贮备液适量，加无水乙醇-乙腈（20∶80，V/V）溶液制成苦参碱、氧化苦参碱质量浓度分别为81.44、168.06 μg/mL的混合对照品溶液。（2）供试品溶液：精密量取离心（3 000 r/min，5 min）后的参黄搽剂上清液15 mL，加浓氨水0.5 mL，放置30 min，然后用三氯甲烷萃取5次，每次20 mL，末次萃取后收集萃取液离心破乳，合并三氯甲烷液，蒸干后残渣用无水乙醇溶解，并转移到5 mL量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。（3）阴性对照溶液：按参黄搽剂处方工艺制备缺苦参的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成缺苦参的阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液（样品批号：180604）、阴性对照溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，以苦参碱、氧化苦参碱峰计的理论板数分别为3 333、6 407，分离度均＞1.5，且阴性对照无干扰，表明该方法具有良好的专属性，色谱图见图5。

图5HPLC图Fig 5 HPLC chromatograms

2.2.4 线性关系考察 精密量取“2.2.2（1）”项下制备好的对照品贮备液适量，加乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）溶液分别制成每1 mL含苦参碱40.72、81.44、22.16、162.88、203.60、244.32 μg和含氧化苦参碱42.02、63.02、84.03、105.04、168.06 μg的混合对照品溶液。按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积（y）对进样量（x）进行线性回归，得到苦参碱的回归方程为：y＝0.458 0x－4.980 6（r＝0.999 4），氧化苦参碱的回归方程为：y＝0.514 2x－5.043 0（r＝0.999 7）。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱分别在进样量为203.60～1 221.60、210.08～840.30 ng范围内与其峰面积呈现出良好的线性关系。

2.2.5 检测限与定量限考察 采用逐步稀释法测定苦参碱、氧化苦参碱的检测限，以信噪比为3（S/N＝3）得出检测限，以S/N＝10得出定量限。结果显示，苦参碱、氧化苦参的检测限分别为50.90、57.30 ng，定量限分别为169.67、168.06 ng。

2.2.6 精密度试验 精密吸取制备好的同一供试品溶液（样品批号：180604）5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为1.72%、2.23%（n＝6），表明该色谱条件下方法精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取制备好的同一供试品溶液（样品批号：180604）5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件，分别在制备样品后0、5、10、15、20、24 h进样，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为1.55%、2.77%（n＝6），均＜3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.8 重复性试验 取同一批次参黄搽剂（样品批号：180604），按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，平行6份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果显示，苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为47.34、30.64 μg/mL，RSD 分别为 2.84%、2.89%（n＝6），均＜3%，表明该方法具有良好的重复性。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的同一批次参黄搽剂（样品批号：180604）7.5 mL，分别按供试品含量的50%、100%、150%加入苦参碱、氧化苦参碱对照品，再按“2.2.2（2）”项下方法制备供试品溶液，每个浓度平行制备3份，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，苦参碱和氧化苦参碱的平均加样回收率分别为96.13%、100.93%，RSD分别为2.55%、2.69%（n＝9），表明该方法准确度较好，结果见表1。

表1 回收率测定结果（n＝9）Tab 1Determination results of relovery rate（n＝9）

2.2.10 样品含量测定 分别精密吸取3个批次参黄搽剂的供试品溶液及混合对照品溶液各5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，每个样品测2次，记录峰面积并计算样品中苦参碱和氧化苦参碱的含量。结果显示，3个批次样品中苦参碱、氧化苦参碱的平均含量分别为46.98、31.02 μg/mL，平均总含量为78.00 μg/mL。根据3批样品含量测定结果可知，制剂中苦参碱和氧化苦参碱总量的平均值为2.34 mg/瓶，按平均含量的80%设限[19]，初步拟定以苦参碱、氧化苦参碱总量计，每瓶制剂中不得少于1.87 mg。样品中苦参碱、氧化苦参碱含量测定结果见表2。

3 讨论

3.1 TLC鉴别方法的确定

本研究对参黄搽剂中苦参、黄柏、大黄、黄芩分别进行了TLC鉴别，所建立的鉴别方法分离度良好、无拖尾现象，且阴性对照无干扰，专属性强，能实现方中各药味的快速鉴别。苦参的鉴别方法笔者参考了药典（一部）[20]苦参项下收载的TLC法并有所调整，药典（一部）中采用加氨水和三氯甲烷放置过夜进行药材提取，笔者考虑到本制剂为经提取过的液体，故将方法调整为加氨水调pH后用三氯甲烷萃取。另外，笔者曾采用在10℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-浓氨（5∶0.6∶0.3，V/V/V）的下层溶液为展开剂进行展开，但斑点比移值（Rf）较高，改为本研究中所用二次展开系统展开后，斑点Rf值适中且分离度好。大黄的鉴别笔者参考了药典（一部）[20]大黄项下收载的TLC法并有所调整，药典（一部）中先加甲醇浸泡提取药材，得甲醇液蒸干后，加水溶解，再加盐酸回流提取，笔者考虑到本制剂为经提取过的液体，故将方法调整为直接加盐酸回流提取；另外，笔者曾用药典展开方法展开，结果TLC图谱中橙黄色荧光斑点不清晰，后改为置于氨气预饱和的展缸中展开，结果斑点清晰。黄柏、黄芩的鉴别分别参考药典（一部）[20]黄柏、黄芩项下收载的TLC法。

表2 参黄搽剂中苦参碱、氧化苦参碱含量测定结果（n＝2，μg/mL）Tab 2 Determination results of matrine and oxymatrine in shenghuang liniment（n＝2，μg/mL）

3.2 HPLC含量测定中供试品溶液制备方法的确定

参黄搽剂中苦参为君药，笔者参考药典（一部）[20]苦参项下收载的含量测定方法，考虑到本品为液体制剂，药材已经经水煮提取，故选择采用萃取的方法对样品中有效成分进行提取。萃取时又发现样品乳化较严重，如果不破乳会影响含量测定结果，经离心破乳后，测定结果重复性高、稳定性好，故采用离心的方法对末次萃取后的混合液进行破乳处理。测定样品时笔者另发现，样品测定结果平行性较差，经排除人为误差影响后，怀疑是处理过程中加氨水将待测生物碱成分游离出来了，该过程需要一定的反应时间，故笔者对加氨水后的放置时间进行了考察，发现加氨水后直接测定时结果平行性较差，而放置30 min后含量测定结果平行性好，且放置60 min与放置30 min比结果相差不大，故确定加氨水放置30 min后再进行测定。此外，笔者对萃取次数还进行了考察，发现苦参碱、氧化苦参碱的含量随萃取次数的增加而增加，但萃取5次后，含量增加不明显，表明萃取5次对苦参碱、氧化苦参碱的提取较完全，故选萃取5次作为样品的提取次数。

3.3 HPLC色谱条件的确定

笔者曾参考药典（一部）[20]苦参项下收载的含量测定方法，在药典规定流动相的基础上，对色谱柱、柱温、流速进行了考察。在色谱柱方面，笔者分别考察了Waters Spherisorb NH2、Thermo Syncronis Amino、Phenomenex Luna NH2这3种不同色谱柱对分离效果的影响，发现该方法对不同色谱柱适应性良好，但Phenomenex Luna NH2色谱柱的色谱峰峰形更好、保留时间适中，故最终选则Phenomenex Luna NH2作为含量测定的色谱柱。在柱温方面，笔者分别考察了35、40、45℃这3种不同柱温对分离效果的影响，结果当柱温为35℃时，苦参碱和氧化苦参碱的分离度均低于1.5，当柱温高于40℃后，苦参碱和氧化苦参碱的分离度均在1.5以上，且其分离度均随柱温的增加而升高，故最终选柱温为45℃。在流速方面，笔者考察了0.8、1.0、1.2 mL/min这3种流速对分离效果的影响，结果流速对分离效果影响不大，综合分析时间及仪器耐用性后，选择1.0 mL/min作为分析流速。最终所建立的含量测定方法专属性强、分离度好。

综上所述，本研究建立了参黄搽剂中苦参、黄柏、大黄、黄芩四味药材的TLC鉴别方法，在建立方法下测得的样品斑点清晰、分离度高，且阴性对照无干扰。此外，本研究还建立了方中苦参碱和氧化苦参碱含量测定的HPLC法，并初步拟定了以苦参碱、氧化苦参碱总量计，每瓶中不得少于1.87 mg的质量标准。本研究所建立的方法可行性高、重复性好，可用于参黄搽剂的质量控制。