HPLC法测定人胸腔积液中左氧氟沙星的浓度及其药动学研究Δ

苏碧雅，张黎明，杨梅珍，邵发林（天水市第一人民医院药剂科，甘肃天水741000）

喹诺酮类抗菌药物是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药，属浓度依赖型抗菌药，第三代喹诺酮类抗菌药物对革兰氏阳性、阴性菌均有较明显的抗菌后效应[1]。左氧氟沙星是临床常用的治疗肺部感染的抗菌药物，在耐药结核杆菌感染的治疗中也被广泛使用，其给药方案多参照血液中的药动学参数制订。有关左氧氟沙星血药浓度的高效液相色谱法（HPLC）已有很多报道[2-4]，但血浆中的内源性杂质与胸腔积液不同，故左氧氟沙星血药浓度监测的HPLC法并不能直接用于左氧氟沙星胸腔积液样品的检测，且血浆中左氧氟沙星的药动学研究也并不能准确反映肺组织中左氧氟沙星的分布情况，因此对感染部位的药物浓度进行测定，具有更大的临床意义。但目前国内尚无文献报道人用左氧氟沙星后，左氧氟沙星在肺部的药动学特征。胸腔积液（Pleural effusion）是以胸膜腔内病理性液体积聚为特征的一种常见的临床症候，对该类患者胸腔积液中左氧氟沙星的药动学进行研究，再根据检测结果结合药动学/药效学理论以及病原菌最低抑菌浓度（MIC）综合分析，能指导临床医师更合理、准确地使用左氧氟沙星，保证用药有效性和安全性。故本文采用HPLC外标法，用甲醇沉淀胸腔积液中蛋白质后，测定左氧氟沙星的含量。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260液相系统，包括二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；TD4B台式低速自动平衡离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；XW-80A旋涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；UPD-І-10T小型纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；MD200-2氮吹仪（杭州瑞诚仪器有限公司）；Eppendorf移液器（德国Eppendorf公司）；AUY220分析天平（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

左氧氟沙星对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130455，纯度：97.1%）；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 胸腔积液来源

本文选择的研究对象为我院呼吸内科收治的6名感染性胸腔积液患者，所采集的胸腔积液为渗出液，研究患者入选标准为（1）肺部感染患者；（2）经胸部CT检查，胸腔积液量达到250 mL以上，可以行胸腔穿刺置管引流术者；（3）静脉滴注左氧氟沙星注射液进行抗感染治疗，给药剂量为0.4 g qd的患者；（4）配合度良好，能保证按时取样的患者。排除标准为（1）单纯性结核性胸腔积液患者；（2）单纯性肿瘤性胸腔积液患者；（3）其他原因不明的胸腔积液患者。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.02 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液[含0.3%三乙胺，70 ∶30（V/V）] ；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：294 nm；进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取左氧氟沙星对照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得400 μg/mL的左氧氟沙星甲醇贮备液，置于4℃冰箱保存。临用前将该贮备液用甲醇逐级稀释成质量浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列对照品溶液即可。

2.3 胸腔积液样品的前处理方法

取胸腔积液样品500 μL，置于离心管中，加甲醇2 000 μL，涡旋混合3 min，4 000 r/min离心15 min后，取上清液于另一离心管中，在相同条件下二次离心，取上清液，用氮吹仪挥干甲醇后，加入500 μL甲醇复溶，涡旋混合均匀后用0.25 μm的微孔滤膜滤过，置于自动进样分析小瓶中，吸取20 μL进样分析。

2.4 专属性考察

取对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。另取6名感染性胸腔积液患者使用左氧氟沙星前抽取的胸腔积液的混合液（简称空白胸腔积液）、空白胸腔积液+对照品、胸腔积液样品（给药后1 h），按照“2.3”项下方法处理后，再按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱。

2.5 线性关系考察

取质量浓度为0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的对照品溶液，各500 μL，分别置于离心管中，用氮吹仪挥干甲醇后，加入空白胸腔积液500 μL，涡旋15 s混合均匀，配成含左氧氟沙星质量浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列质控样品，每个浓度平行做3份，按照“2.3”项下方法处理后，再按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，重复3次，取平均值。以左氧氟沙星峰面积（A）为纵坐标，质量浓度（c）为横坐标，进行回归分析。

2.6 检测限与定量下限考察

将质量浓度为0.625 μg/mL的对照品溶液，逐级稀释后，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，以信噪比为3∶1，确定左氧氟沙星的检测限；以标准曲线的最低点为左氧氟沙星的定量下限。

2.7 相对回收率试验

取质量浓度为1.25、10、15 μg/mL的对照品溶液，各500 μL，分别置于离心管中，用氮气仪挥干甲醇后，加入空白胸腔积液500 μL，制成质量浓度分别为1.25、10、15 μg/mL的质控样品，每个浓度平行做3份，按照“2.3”项下方法处理后，再按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积A1。取空白胸腔积液适量，按照“2.3”项下方法处理后，加入对照品溶液制备成相应质量浓度的溶液，再按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积A2。以A1/A2计算相对回收率。

2.8 精密度与准确度试验

取质量浓度为1.25、10、15 μg/mL的对照品溶液，各500 μL，分别置于离心管中，用氮气仪挥干甲醇后，加入空白胸腔积液500 μL，制成质量浓度分别为1.25、10、15 μg/mL的质控样品，每个浓度平行做5份，按照“2.3”项下方法处理后，再按照“2.1”项下色谱条件进样，同一天内测定3次考察日内精密度；每天测定1次，连续测定3 d，考察日间精密度；将测得峰面积代入回归方程计算左氧氟沙星的浓度，以实测值/加入值计算准确度。

2.9 稳定性试验

取质量浓度为1.25、10、15 μg/mL的对照品溶液，各500 μL，分别置于离心管中，用氮气仪挥干甲醇后，加入空白胸腔积液500 μL，制成质量浓度分别为1.25、10、15 μg/mL的质控样品，每个浓度平行做15份，取3份按“2.3”项下方法处理后立即进样分析；3份室温下放置4 h后按“2.3”项下方法处理后进样分析；3份按“2.3”项下方法处理后再置于4℃冰箱放置12 h后进样分析；3份于冰箱中冷冻保存4周后取出融化，再按“2.3”项下方法处理后进样分析；3份反复冻融3次后再按“2.3”项下方法处理后进样分析，考察稳定性。

2.10 药动学考察

按“2.3”项下方法处理6名感染性胸腔积液患者静脉滴注左氧氟沙星0.4 g qd后0.5、1、2、4、8、12、24 h的胸腔积液，再按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，代入回归方程计算浓度。使用GraphPad软件绘制胸腔积液中左氧氟沙星的药-时曲线，将上述浓度数据代入WinNonlin 5.2软件计算药动学参数。

3 结果

3.1 专属性

在“2.1”项色谱条件下，左氧氟沙星的保留时间为4.9 min左右，峰形良好，与前后邻近峰能有效分离，胸腔积液中内源性物质对其测定无干扰，基线平稳。色谱图见图1。

3.2 线性关系

得回归方程为A＝40.71c+1.640 3（R2＝0.998 9），胸腔积液中左氧氟沙星检测质量浓度的线性范围为0.625～20 μg/mL。

3.3 检测限与定量下限

胸腔积液中左氧氟沙星的检测限为0.156 μg/mL，定量下限为0.625 μg/mL。

3.4 相对回收率

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

结果显示，质控样品中左氧氟沙星的相对回收率均在80%以上，符合相关要求规定。相对回收率结果见表1。

表1 相对回收率结果（n＝3）Tab 1Results of relative recovery rate（n＝3）

3.5 精密度和准确度

结果显示，测得浓度的日内、日间RSD均小于5%，准确度在（97.76±4.85）%～（100.87±2.25）%范围内，均符合相关规定。精密度与准确度结果见表2。

表2 精密度与准确度结果（n＝5）Tab 2Results of precision and accuracy（n＝5）

3.6 稳定性

结果显示，测定浓度的RSD均小于5%，质控样品的稳定性良好。稳定性结果见表3。

表3 稳定性结果（n＝3）Tab 3Results of stability（n＝3）

3.7 药动学

胸腔积液中左氧氟沙星的药-时曲线见图2，药动学参数见表4。

4 讨论

4.1 检测波长的确定

2015年版《中国药典》记录的左氧氟沙星HPLC法中紫外检测波长为294 nm和238 nm[5]。本文前期研究发现，检测波长为294 nm时胸腔积液内源性物质对左氧氟沙星出峰干扰最小，灵敏度较高，所以本文最终选取294 nm作为左氧氟沙星的检测波长。

图2 胸腔积液中左氧氟沙星的药-时曲线Fig 2 Plasma concentration-time curve of levofloxacin in pleural effusion

表4 胸腔积液中左氧氟沙星的药动学参数（n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameter of levofloxacin in pleural effusion（n＝6）

4.2 柱温的选择

在HPLC法检测中，提高柱温可以降低流动相的黏度、增加样品在流动相中的溶解度、缩短样品的保留时间，故控制柱温可调整待测物质出峰时间。经过对不同柱温的测试，比较了柱温为25、30、35℃时左氧氟沙星的吸收峰的峰形、拖尾因子及与其他峰的分离度等，同时考虑到柱温过高可能缩短色谱柱寿命、影响生物样品的稳定性，故最终柱温定为35℃。

4.3 蛋白沉淀剂的选择

甲醇和乙腈为HPLC检测最常用的两种有机流动相，选择甲醇和乙腈为蛋白沉淀剂可以最大程度的减少溶剂效应的影响，故本研究选择蛋白沉淀剂时分别试用了乙腈和甲醇。结果发现，乙腈和甲醇作为蛋白沉淀剂均能满足相关要求，但考虑到甲醇毒性较乙腈低，故选择甲醇作为本实验的蛋白沉淀剂。体外药物分析时一般采用外标法，体内药物分析因提取步骤烦琐，都采用内标法进行校正，但因为本方法仅使用4倍体积甲醇沉淀蛋白，无提取等烦琐步骤，而且仪器稳定性、方法的精密度均良好，故选择用外标法进行定量测定。

4.4 方法实用性

左氧氟沙星为临床常用的喹诺酮类抗菌药物，抗菌谱广，可用于治疗铜绿假单胞菌引起的感染[6]、鲍曼不动杆菌引起的感染[7]，也可与其他抗结核药物联用用于治疗耐药结核菌感染[8]。左氧氟沙星在治疗肺部、胆系、泌尿系、肠道等部位感染中使用广泛，其在肺组织中浓度高，是治疗肺部感染的常用抗菌药物，但目前对左氧氟沙星肺部的药动学研究多停留在动物实验阶段[9]。本研究以甲醇和磷酸二氢钾缓冲液为流动相，以甲醇为沉淀剂，建立测定患者胸腔积液中左氧氟沙星浓度的HPLC法，样品处理方便，出峰速度快，10 min即可完成1个样品分析，分析成本较低，适用于临床左氧氟沙星胸腔积液浓度测定及左氧氟沙星的肺部药动学研究。