基于高通量测序研究文献和预测微生物学软件的泡菜中常见食源性致病菌风险分析

闫鸣霄，吴正云，全江龙，张文学

(四川大学 轻纺与食品学院食品工程系，成都 610065)

泡菜是我国传统的发酵蔬菜制品，一般以新鲜蔬菜为主要原料，辅以大蒜、生姜等调味料，添加适量盐，经自然发酵或添加外源发酵剂发酵，形成了其独特的风味和香气。泡菜发酵中涉及大量的微生物，除乳酸菌外，原料和操作环境中可能带入包括食源性致病菌在内的各种污染微生物[1-4]。目前对泡菜中污染微生物的研究仍以传统的培养计数方法为主，近年来，高通量测序技术的发展为泡菜微生物检测提供了更为高效、准确的方法。但目前泡菜微生物高通量测序研究多集中在多样性分析方面，对食源性致病菌关注不多。预测微生物学采用数学方法描述微生物数量变化和环境因子之间的响应关系，能为在不同条件下发酵泡菜中食源性致病菌的生长趋势探讨提供参考。

本研究基于泡菜微生物高通量测序的文献数据和预测微生物学数据库软件模拟的微生物生长结果，探究了一些发酵操作条件对泡菜中常见食源性致病菌污染风险的影响，初步分析了不同发酵条件下泡菜发酵前期几种食源性致病菌生长的风险。

1 材料与方法

1.1 高通量测序研究文献数据的获取及分析

在CNKI和Web of Science数据库中，利用“泡菜”、“高通量”、“PCR”、“多样性”等关键词，以建库到2018年7月为时间范围，进行相关文献检索。然后通过人工方式对所得文献再次筛选，剔除重复和无效文献。要求最终所选文献包含通过高通量测序手段测得的泡菜中食源性致病菌多样性的信息，除此之外，还应包括泡菜的样品类别、发酵方式、发酵原料、发酵剂类型、发酵温度、发酵盐度以及泡菜辅料等。根据NCBI的物种分类数据库确定各种食源性致病菌的分类关系(见表1)，以1和0分别表示某一致病菌或其所在的分类在泡菜样品中存在或不存在；文献中未提及的数据标记为缺失。相关性分析采用SAS 6.12进行。

表1 常见食源性致病菌的微生物学分类Table 1 The microbiological classification of common food-borne pathogens

1.2 基于Comebase数据库软件的常见食源性致病菌在泡菜发酵前期的生长趋势预测

采用Combase数据库的Predictor软件，选择在泡菜发酵前期可能出现的盐度、pH和温度条件，对大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌(有亚硝酸盐)、蜡状芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌和假单胞菌8种食源性致病菌的生长趋势进行模拟分析。

2 结果与分析

2.1 基于泡菜微生物高通量测序研究文献数据的致病菌污染风险分析

根据前述标准，分别在CNKI和Web of Science数据库中检索到68篇和29篇文献，通过人工方式再次筛选，各得到7篇和8篇，共计15篇符合要求的文献[5-19]，总计43个泡菜样本。其中，涉及的样品类别有家庭泡菜和工业泡菜；发酵时间为1～65.5 d；发酵剂类型有自然发酵、泡菜母水发酵和发酵剂发酵；发酵原料有白萝卜、胡萝卜、白菜、雪菜、榨菜、豇豆、青菜、芥菜、辣椒、混合原料(白萝卜+胡萝卜)、混合原料(白菜+胡萝卜+白萝卜)、混合原料(白菜+胡萝卜+豇豆)；泡菜辅料有混合辅料(生姜+辣椒+花椒)、混合辅料(辣椒+花椒)、混合辅料(生姜+胡椒+青椒)、混合辅料(生姜+辣椒+大蒜)；发酵温度为18.5～25 ℃；发酵盐度为2%～11%。

根据泡菜中常见食源性致病菌的生物学分类统计(见图1)，常见的食源性致病菌大肠杆菌和沙门氏菌分别所在的埃希氏菌属和沙门氏菌属在43个泡菜样品中未检出，但其所属的肠杆菌科在绝大部分泡菜样品中检出。肠杆菌科下的肠杆菌属检出较多，志贺菌属和克吕沃尔氏菌属、沙雷氏菌属、泛菌属等条件致病菌也有检出。从这些结果看，在泡菜的发酵制作中肠杆菌科微生物存在较多。肠杆菌科中大肠杆菌较为常见，但在本次所分析的泡菜样品中未检出，分析其原因是其在泡菜发酵后期消失。

金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡状芽孢杆菌所在的各属有检出。分析原因在于其各自具有不同的耐盐耐酸性机制。金黄色葡萄球菌由于细胞壁含多层肽聚糖和细胞表面特殊的盐应激蛋白而具有独特的耐盐特性[20]；单核细胞增生李斯特菌具有多种抗酸应激系统[21,22]；蜡状芽孢杆菌芽孢的特殊结构使其相对耐盐耐酸[23]。

假单胞菌属被检出较多，致病菌铜绿假单胞菌也多次检出。分析原因是发酵泡菜水可能受到污染[24]或者操作人员手未经消毒直接接触原料、水和发酵容器等。产气荚膜梭菌所属梭菌属也有检出。

图1 泡菜样品中食源性致病菌在属(A)、 科(B)、目(C)水平上的相对检出率Fig.1 The relative detection rates of common food-borne pathogens in pickle samples in the genera (A), the families(B) and the divisions(C) levels

泡菜发酵操作方式与常见食源性致病菌所属分类检出的相关性分析结果显示：泡菜类别、发酵时间、发酵剂类型、发酵原料、发酵温度、发酵盐度以及泡菜辅料等因素与食源性致病菌的出现之间有一定相关性。

泡菜样品类别与肠杆菌目、肠杆菌科和假单胞菌目、假单胞菌科的出现呈极显著相关性(相关性系数>0.5)，即家庭泡菜出现肠杆菌属和假单胞菌属致病菌的频率更高，分析其原因是家庭泡菜盐度较低且制作过程中卫生条件控制相对较差；而李斯特菌属则更多出现在工业泡菜中，分析是由于其耐盐性较强，因而在盐度较高的工业泡菜中更易存活。

在各种泡菜原料中，萝卜、白菜泡菜中出现致病菌的概率较高，推测是由于这两种原料本身带菌较多或其所含的营养物质丰富有利于致病菌生长繁殖。

发酵时间越长，葡萄球菌属和李斯特菌属致病菌检出率越高，而假单胞菌属致病菌检出率越低。分析其原因是发酵时间长(即发酵过程缓慢，多出现于高盐度发酵中)，pH降低缓慢，使得耐酸和耐盐性较强的葡萄球菌属和李斯特菌易于存活。

使用发酵剂发酵的泡菜中梭菌属检出较多，推测发酵剂可能受到梭菌属污染，具体原因有待进一步探究。

发酵温度与假单胞菌属的检出呈明显的负相关性(相关性系数>0.5，P<0.01)，分析原因是泡菜样品中出现的假单胞菌多为适宜在低温下生长的菌种。有研究显示铜绿假单胞菌最适生长温度为30～35 ℃[25]，但也有研究显示莓实假单胞菌、荧光假单胞菌在0～7 ℃时仍保持较高活力[26]，对于假单胞菌种类与温度之间的响应机制仍需深究。

泡菜辅料和发酵盐度与泡菜中食源性致病菌的相关性不明显，可能是由于所选文献中的有关数据不足。

2.2 基于预测微生物软件的泡菜发酵前期常见食源性致病菌的生长趋势预测

传统的工业泡菜生产中多采用高盐度(10%以上)发酵。由于高盐发酵食物可能诱发糖尿病、心脏病、高血压等疾病[27，28]，中低盐度(2%～5%)发酵成为泡菜生产的趋势之一。在泡菜发酵中起始pH一般为 6～6.5，随着发酵的进行，pH逐渐下降并最终达到3～4[29]。研究显示，杂菌数量在泡菜发酵前期通常有一定程度增加，达到峰值后逐渐下降[30]。多数食源性致病菌所能耐受的最低pH为4.5～5，因此在泡菜后期不能生长，但在泡菜发酵前期pH较高的条件下，仍可能出现生长而引起风险，尤其是短期发酵和即食泡菜中。

采用Predictor软件对几种常见食源性致病菌的生长趋势模拟结果显示，随着pH的降低和盐浓度的提高，各种食源性致病菌生长总体上明显减缓。在pH 4.5条件下，耐酸能力较弱的蜡状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌和志贺氏菌等不能生长。在高盐浓度(10%)下，多数致病菌不能生长，但金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌仍可能生长，其中金黄色葡萄球菌的生长优势更明显(详细数据略)。在中等盐浓度(4.6%)下，沙门氏菌生长速率最快，其次为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌(见图2A)。在低盐浓度(2%)下，几种致病菌、尤其是大肠杆菌生长速度明显加快(见图2B)。

由图2可知，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌在中、低盐浓度泡菜发酵前期都有可能出现明显的生长。关于泡菜中大肠杆菌的报道较多[31]，单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌在泡菜中的检出也有报道，但在上述模拟分析中尤其具有明显生长优势的沙门氏菌在泡菜中的检出尚未见报道，分析可能有两方面原因：高通量测序样品偏少，且多数未针对发酵前期进行检测；蔬菜中的沙门氏菌分布不多，随着发酵过程进行而迅速死亡。由于沙门氏菌较高的危害性，对于其是否能在泡菜前期繁殖和消失规律有待于进一步考察。

图2 采用Predictor软件对中、低盐度泡菜发酵前期 条件下大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单 核细胞增生李斯特氏菌生长趋势的预测Fig.2 The prediction of growth trend of Enterobacter, Salmonella, S.aureus and L.monocytogenes in prophase pickle fermentation under conditions of medium and low salinity by using Predictor software

注：温度为25 ℃；pH为4.5；A为盐度4.6%；B为盐度2%。

在家庭泡菜制作中，因使用的盐度一般较低，相对更易受到上述几种肠杆菌科致病菌的污染。在工业泡菜制作中，由于盐度偏高，肠杆菌科致病菌不易生长，而金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌因耐盐性较强有可能出现生长，这与前文对高通量测序的分析结果保持一致。

3 结论

对发酵泡菜中常见食源性致病菌高通量测序的文献数据分析结果显示，泡菜发酵操作和泡菜中食源性致病菌的出现有明显的关联。家庭泡菜易出现肠杆菌属和假单胞菌属致病菌，而工业泡菜中李斯特菌属致病菌出现机会较大；萝卜、白菜泡菜中出现致病菌的机会相较其他泡菜原料更大；发酵时间与葡萄球菌属和李斯特菌属致病菌出现表现出明显的正相关。

采用Predictor软件对泡菜发酵前期的模拟分析结果显示，高盐泡菜中金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌有可能生长；中、低盐泡菜中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌都可能出现明显生长，沙门氏菌尤其具有较大的生长优势。