二轮盐渍工业泡菜微生物群落结构解析

汪冬冬，陈功,2，李恒,2，唐垚，万鹏，张其圣,2*

(1.四川东坡中国泡菜产业技术研究院，四川 眉山 620000；2.四川省食品发酵工业研究设计院， 成都 611130；3.四川省川南酿造有限公司，四川 眉山 620000)

利用食盐对新鲜蔬菜进行渍制加工而成的蔬菜制品，称之为盐渍菜。泡菜是盐渍菜中的一种，在我国尤以四川泡菜最具代表性，其品种繁多，风味独特，得利于适宜的气候条件和丰富的蔬菜资源[1,2]。泡菜发酵是微生物群落的种类和数量不断演替变化的过程，是多种微生物相互作用的复杂过程，其以活性乳酸菌群主导发酵。

四川泡菜在工业化生产过程中，由于加工的需要，蔬菜需要进行发酵和后期成熟的过程。在工业生产泡菜中尤其是二轮发酵工艺最有代表性。该工艺将新鲜蔬菜采用低盐快速发酵，当产品酸度达到一定程度以后，快速翻池，进入第二轮发酵与后熟储存的过程。产品在第一轮发酵过程中由于盐度低(一般盐度低于5%)、发酵速度快，可以快速消除蔬菜本身的生味，进入成熟期。根据加工的需要，第一轮发酵后的蔬菜制品可以直接进入后续工段加工成为泡菜，也可以在进行第二次高盐度储存发酵(一般大于8%)，实现周年加工的目的。经过第二轮发酵的产品，由于发酵时间长、风味好，往往更容易受到消费者的喜爱。

微生物的发酵作用可能是导致第一轮发酵与第二轮发酵蔬菜制品品质差异的主要原因。针对第一轮低盐发酵过程的产品已经有大量的报道，乳杆菌属主导了整个发酵过程。如田伟等[3]利用16S rRNA分析传统四川发酵泡菜中的细菌多样性，其中Lactobacillus和Pediococcus两个属，所占比例分别为88.4%和10.1%。李正国采用传统分离培养和DGGE法检测榨菜中乳杆菌属是优势菌群。翁佩芳等[4]发现榨菜腌制初期优势菌群为肠膜明串珠菌, 随后转变为植物乳杆菌和短乳杆菌占优势，腌制后期主要为植物乳杆菌等。然而针对第二轮高盐储存过程中，认识有较大差异，如在细菌方面，一些人认为该发酵过程中以乳杆菌为主导发酵[5]；另外一些人则认为泡菜是以乳杆菌主导发酵，但也发现了大量的芽孢杆菌[6]；一些学者发现高盐盐渍发酵的蔬菜制品也有报道以芽孢杆菌属(Bacillus)为主导[7]。Liang H采用高通量测序的方法研究发现Lactobacillus主导榨菜发酵中段，以Lactobacillus和Pediococcus为主[8]。在真菌方面，罗青春等研究了规模泡菜中，萝卜、豇豆、青菜和榨菜的主要优势酵母菌分别为Debaryomyces；Debaryomyces和Starmerella；Debaryomyces；Starmerella，Debaryomyces和Candida[9]。尹礼国采用DGGE发现不同盐渍青菜样品的优势真菌与假丝酵母属、德巴氏酵母属、接合酵母属的菌株相似[10]。张先琴发现季也蒙假丝酵母在泡菜发酵真菌中占主导[11]；Liang H采用高通量测序的方法研究发现Debaryomyces是榨菜的主导真菌。

从目前的研究来看，对传统泡菜中微生物菌群结构研究较多，而二轮高盐发酵泡菜少有报道，且大多数有关泡菜中微生物的研究多集中在乳酸菌方面。本研究采用可培养方法，探讨二轮高盐发酵泡菜中微生物群落结构，为进一步对微生物进行深入研究，尤其对高盐蔬菜制品特有的风味品质，构建微生物与品质之间的关联具有重要的意义，以期为后续优化泡菜生产工艺，实现人工控制泡菜发酵过程奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

泡菜原料为发酵1年以上的盐渍豇豆(J)、盐渍青芥菜(Q)、盐渍萝卜(L)，取自四川眉山某泡菜厂盐渍池；PCA培养基、PDA培养基：北京奥博星生物技术有限公司；Bacterial DNA Isolation Kit、2×PCR Mix(ForegeneTaq DNA聚合酶、dNTPs、Tris-HCl、KCl、MgCl2)：成都福际生物技术公司；Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit：美国Biomiga公司；琼脂糖：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：成都市科龙化工有限公司；PCR引物(见表1)：成都擎科梓熙生物技术有限公司。

表1 PCR引物表Table 1 PCR primer list

1.2 仪器与设备

DHP-9080B恒温培养箱、DYCP-31DN琼脂糖水平电泳仪、HH-4恒温水浴锅 成都智诚科灵仪器仪表有限责任公司；TGL-20BR台式冷冻离心机、T960梯度PCR热循环仪、IY04S-3E型凝胶成像分析系统、PHS-3C型精密pH计 成都一科仪器设备有限公司；BL SMART型拍打式均质机 意大利ASTORI公司。

1.3 试验方法

1.3.1 pH、总酸与盐度的测定

依据GB 10648—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》测定泡菜的pH；按照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定样品中的总酸含量，结果以乳酸计；依据GB/T 12457—2008《食品中氯化钠的测定》中滴定法测定泡菜的食盐浓度。

1.3.2 微生物计数

将25 g泡菜加入到含有225 mL无菌生理盐水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2 min，匀浆后进行1∶10梯度稀释，制成样品菌悬液。取适当稀释度的菌悬液分别接入不同培养基中涂布培养后计数，平行重复3次，取其平均值。其中PCA培养基于37 ℃培养48 h，PDA培养基于28 ℃培养48 h，以未接菌株的培养基作为空白对照。观察不同培养基中典型菌落的菌落形态、个体形态和染色特征，划线法分离纯化各菌株。

1.3.3 菌相分析

1.3.3.1 细菌16S rDNA序列测定

菌株DNA的提取参照细菌DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)说明书方法进行。PCR体系(50 μL)：2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 1.5 μL，引物27F(10 μmol/L)和1492R(10 μmol/L)各2 μL，加双重蒸馏水补充至50 μL。反应程序参照Haruta等[12]的方法进行。

1.3.3.2 真菌26S rDNA序列测定

菌株DNA的提取参照试剂盒方法(Biomiga EZgene TM Fungal gDNA Miniprep Kit)进行。PCR反应体系(50 μL)组成：2×PCR Mix 25 μL，模板DNA 1.5 μL，引物NL1(10 μmol/L)和NL4(10 μmol/L)各2 μL，加双重蒸馏水补齐50 μL。反应程序参照Tofalo等[13]的方法进行。

1.3.3.3 序列测定

PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，细菌目标条带为1500 bp左右，真菌目标条带为600 bp左右。将符合16S rDNA和26S rDNA片段大小的PCR扩增产物送至成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，测序结果利用BLAST软件在GenBank数据库中进行比对。

1.3.4 数据分析

本研究实验数据通过Excel 2007软件进行统计分析，数据导入Origin 9.1中作图进行比较，菌相构成采用PermutMatrix进行heatmap和聚类分析，同时采用Sorensen similarity index评价不同泡菜样品细菌和真菌的相似程度，并通过biodap进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 泡菜一般性质

本研究中的4种不同原料泡菜样品全部为发酵1年以上，其pH、总酸和盐度见表2。

表2 4种不同原料泡菜样品理化指标测定结果Table 2 Determination resuts of physicochemical indexes of four pickle samples with different raw materials

由表2可知，4种不同原料泡菜pH处于3.59～4.06之间，一般认为pH<4表示泡菜发酵完成[14]；总酸含量都大小0.5 g/100 g，一般认为酸度在0.5%～0.8%左右，泡菜质量最好；盐度都大小12 g/100 g，属于高盐发酵，这与高盐有利于盐渍菜长时间储存的工艺有关。表明该阶段泡菜环境已经形成一定的缓冲体系，较稳定。

4种不同原料泡菜的细菌和真菌菌落总数情况见图1，菌落总数都小于105CFU/mL，此时，微生物作用对泡菜影响较小，且萝卜、豇豆、榨菜中细菌都低于真菌总数。在盐渍泡菜发酵后期，在高盐条件下，微生物受低pH和高酸度的影响，大部分死亡或被抑制，存留少部分耐盐且耐酸的微生物。

图1 4种不同原料泡菜菌落数Fig.1 Colony number of four pickles with different raw materials

2.2 细菌群落构成

4种不同原料泡菜样品中共分离出细菌93株，盐渍豇豆、盐渍萝卜、盐渍青菜、盐渍榨菜分别鉴定出28，21，19，25株。经鉴定，93株菌分为6个属，分别为芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、虚构芽孢杆菌属(Fictibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)。4种不同原料泡菜中芽孢杆菌占主导，分别占到78.1%、100.0%、78.9%、62.5%。这与报道中的泡菜发酵后期乳杆菌占主导不一致，这可能与盐渍泡菜后期长时间贮藏有关。经过二轮加盐长时间贮存，在高盐、低pH、高酸条件下，泡菜中大部分微生物生长受到抑制和死亡，存留的乳酸菌都耐盐耐酸。工业化的泡菜都为自然发酵，粗犷式生产，芽孢杆菌多数来源于原料表面或环境，其对外界有害因子抵抗力强，生命力强，在乳酸菌减少的情况下逐渐占据优势。

从属水平上分析，可以把盐渍豇豆和盐渍青菜分为1类，盐渍萝卜和盐渍榨菜各分为1类，具体分析见图2A。细菌分为6个属，包含20个种，盐渍豇豆中占6种，占主导的为高地芽孢杆菌(Bacillusaltitudinis，46.4%)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，17.9%)。盐渍萝卜中占10种，占主导的为壁芽孢杆菌(Bacillusmuralis，23.8%)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis，23.8%)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium，14.3%)。盐渍青菜中占10种，占主导的为高地芽孢杆菌(B.altitudinis，26.3%)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium，21.1%)和甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus，10.5%)。盐渍榨菜中占8种，占主导的为消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius，29.2%)、高地芽孢杆菌(B.altitudinis，29.2%)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium，20.1%)，4种不同原料泡菜样品细菌群落结构详见图2B。

细菌通过相似度分析，除了盐渍榨菜和青菜、盐渍榨菜和萝卜相似性较差外，其余泡菜间相似性都大于0.7，差异小，说明泡菜发酵到后期，经过环境对菌群的“自净化”，原料种类对细菌影响较小，见表3。

图2 四个不同原料泡菜细菌heatmap图Fig.2 Heatmap diagram of bacteria in four pickles with different raw materials

相似性系数JLQZJ10.7810.8870.823L10.7890.625Q10.719Z1

泡菜发酵到后期，由于酸度和低pH的原因，微生物数量较少，此阶段发酵微弱，处于发酵贮藏阶段。泡菜在贮藏过程中，由于受到环境或者人为因素的影响，泡菜的品质会逐渐降低，出现软化、“生花”等腐败现象，这主要与腐败微生物有关。本实验鉴定细菌多数来源于蔬菜的表面和环境，具有耐酸耐盐能力，这些菌与盐渍发酵泡菜品质降低相关。其中，蔡炯等[15]研究了腐败泡菜中甲级营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等是腐败泡菜中主要的微生物。王猛等[16]发现腐败泡菜中出现甲级营养型芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等。

2.3 真菌群落构成

4种不同原料泡菜样品中共分离出真菌71株，其中盐渍豇豆、盐渍萝卜、盐渍青菜、盐渍榨菜分别鉴定出26，20，17，8株。经鉴定，71株真菌分为7个属，分别为Millerozyma、毕赤酵母属(Pichia)、布勒掷孢酵母属(Bullera)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、假丝酵母属(Candida)。盐渍豇豆中假丝酵母属为优势菌，占到76.9%；盐渍萝卜中德巴利氏酵母属和接合酵母属占主导，分别占到55.0%和20.0%；盐渍青菜中假丝酵母属和毕赤酵母属占主导，分别占到70.6%和23.5%；盐渍榨菜中假丝酵母属和德巴利氏酵母属占主导，分别占到75.0%和25.0%。

图3 四个不同原料泡菜真菌heatmap图Fig.3 Heatmap map of four pickles fungi with different raw materials

从属水平上分析，可以把盐渍豇豆和盐渍榨菜分为1类，盐渍萝卜和盐渍青菜各分为1类，具体分析见图3A。

真菌7个属的菌株与以下8个种比较相近，其中盐渍豇豆占5种，占主导的为蜂生假丝酵母(Candidaapicola)，占到76.9%；盐渍萝卜中占4种，占主导的为汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和二孢结合酵母(Zygosaccharomycesbisporus)，分别占到55.0%、20.0%；盐渍青菜中占4种，占主导的为埃切假丝酵母(Candidaetchellsii)和膜醭毕赤酵母(Pichiamembranifaciens)，分别占到55.8%、23.5%；盐渍榨菜中占2种，炼乳假丝酵母(Candidalactiscondensi)和汉逊德巴利酵母(D.hansenii)占主导，分别占到75.0%、25.0%，该结果与罗青春等人的研究结果相一致。4种不同原料泡菜样品细菌群落结构见图3B。

真菌通过相似度分析，豇豆与榨菜较相似，萝卜与青菜相似性较差，说明不同原料种类泡菜后期真菌群落结构不同，该结果和聚类分析相一致，见表4。

表4 四个不同原料泡菜样品真菌相似性Table 4 Fungi similarity of four pickle samples with different raw materials

有机酸形成酸性环境，有利于发酵蔬菜的贮藏，其对腐败微生物具有抑制作用[17]。泡菜在发酵后期，乳酸菌生长受到抑制，数量降低，且乳酸被一些酵母消耗[18-23]。酵母菌在泡菜发酵过程中能产生乙醇，一定量的条件下可增加泡菜的风味，其与有机酸等结合生成酯类等香气。酵母菌在厌氧的条件下能产生芳樟醇、苯乙醇等萜类物质，还产生乙酸乙酯等酯类香气[24]。

其中德巴利氏酵母是泡菜中常见的一种酵母，利用大量糖进行繁殖产生乙醇、3-甲基-1-丁醇等物质[25]；球拟酵母可产生烷基苯酚类香味物质，汉逊氏酵母发酵力强，能产生乙酸乙酯[26]，这可能是二轮盐渍泡菜比一次盐渍泡菜香气更足的原因。同时也发现，泡菜存在的假丝酵母、毕赤酵母是泡菜中典型的腐败酵母，大量研究报道这些微生物与泡菜产生浮膜、腐败等有关[27-29]。

3 结论

通过可培养方法结合16S rDNA和26S rDNA序列鉴定技术，对四川工业化二轮盐渍泡菜中细菌和真菌群落结构进行分析。结果表明：长时间储存的工业化盐渍泡菜pH低、酸度和盐度高，微生物数量都小于105CFU/mL，发酵程度微弱。4种不同原料泡菜中细菌分离鉴定出93株菌，总共6个属20个种，4种不同原料泡菜芽孢杆菌属占主导，豇豆、萝卜、青菜和榨菜的主要优势细菌为B.altitudinis和B.subtilis；B.muralis，B.altitudinis和B.megaterium；B.altitudinis，B.megaterium和B.methylotrophicus；L.alimentarius，B.altitudinis和B.megaterium。真菌共分离鉴定出71株菌，共分为7个属8个种，豇豆、萝卜、青菜和榨菜的主要优势真菌为Candida；Debaryomyces和Zygosaccharomyces；Candida和Pichia；Candida和Debaryomyces。其中Bacillus，Candida，Pichia等是降低泡菜品质的腐败微生物，可能与长时间盐渍发酵泡菜品质逐渐降低有关，同时二轮盐渍发酵泡菜中存在球拟酵母和汉逊氏酵母等增香酵母，这与二轮盐渍泡菜比一次盐渍泡菜香有关。不同原料泡菜在后熟阶段细菌差异较小，真菌差异较大，此结果揭示了四川工业化二轮盐渍泡菜长时间储存后微生物群落结构，为企业生产和研发耐盐耐酸的直投式菌剂提供了参考价值。