香辛方外敷对肺癌骨癌痛小鼠炎性介质和MCP-1的影响

何佩珊，冯兴中，姜 敏，潘国凤，杨公博，杨 萌，齐 慧

癌性疼痛是晚期肿瘤最常见的症状之一[1]，严重影响患者生活质量[2]。前期研究显示，芳香类中药外敷能降低骨转移癌痛小鼠机械性痛觉和热刺激痛觉[3-4]。本研究应用活体荧光成像肺癌骨转移癌痛模型，探讨芳香类中药外敷缓解骨转移癌痛的机制，为进一步研究其机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞株 SPF级雌性BALB/c-nu小鼠共40只，4周龄，体质量（18±2）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物许可证号SCXK（京）2014-0004。转染绿色荧光蛋白的人肺腺癌A549细胞株，由安泰康生物技术（北京）有限公司提供。

1.2 药物 香辛方以丁香、细辛（1∶2）研磨成粉调匀，加入透皮吸收剂薄荷醇，由首都医科大学附属北京世纪坛医院药剂室制作。扶他林乳膏剂1% 20 g，国药准字H19990291，北京诺华制药有限公司。

1.3 主要试剂及仪器 75%乙醇（批号11151107），山东利尔康医疗科技股份有限公司；戊巴比妥钠（批号p3761），Sigma公司。注射器（批号329461），美国BD公司；FluorVivo-Model-100荧光成像仪，美国INDEC BioSystems公司；奥豪斯电子精密天平，美国OHAUS公司（型号CP323C）；医学图像采集系统，日本奥林巴斯株式会社；倒置显微镜，日本NIKON株式会社（型号 MA100）。

1.4 小鼠骨转移癌痛活体荧光成像模型建立 参考文献[5]方法，裸鼠麻醉(戊巴比妥钠麻醉)后，仰卧，腹部朝上，用75%乙醇消毒股骨处皮肤。膝关节处与股骨垂直方向切一长0.3～0.5 cm的皮肤切口，小心暴露髌骨。先用一次性无菌1 mL注射器针头在髌骨沿股骨长轴方向穿刺打孔，然后换上30 μL注射器进入股骨骨髓腔，缓慢注入50 μL表达绿色荧光蛋白的人肺腺癌A549细胞（1×106/mL）至股骨。注射完毕，用骨蜡封住针孔（图1）。无菌棉签蘸生理盐水清洗创口，皮肤缝合。建模后第3 d，以FluorVivo-Model-100荧光成像仪对所有小鼠进行全身成像（图2）。假手术组在股骨注入等体积的生理盐水，其余操作同上。造模第7 d，小鼠缩足反应增多，表明癌痛模型造模成功[3]。

图1 小鼠肺癌骨转移癌痛造模照片

图2 骨转移癌痛模型荧光显像图

1.5 分组与给药 将造模成功的30只小鼠采用随机数字表法分为中药外敷组、扶他林组、模型组，每组10只；另设假手术组10只。中药外敷组给予香辛方0.5 g/(kg·d)，于术后7～21 d相同时间（9：00）外敷。于手术切口旁开约0.2 cm局部贴敷，至少持续6 h，1次/d。扶他林组（标准对照组）给予扶他林局部用药0.1 g/(kg·d)，于相同时间进行局部涂抹，1次/d。模型组（一般对照组）和假手术组（无肿瘤负荷）给予涂擦生理盐水0.5 mL/只，1次/d。

1.6 观察指标及方法 采集标本进行指标测定。造模21 d后，麻醉处死小鼠，在冰上剥离出小鼠腰椎（L3～L5）脊髓，迅速放入液氮中保存。严格按照酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）检测实验小鼠血浆（或血清）白介素-lβ（interleukin lβ，IL-lβ）、白介素 -6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子 α（tumour necrosis factor α, TNFα）及脊髓组织单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资采用均数±标准差（）表示，多组间的比较采用单因素方差分析，后采用SNK进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 腰椎脊髓MCP-1的表达 经SNK法多重比较显示，各组两两比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。模型组脊髓MCP-1表达比假手术组升高（P＜0.01），提示骨癌痛小鼠出现了痛觉中枢敏化。中药外敷组脊髓MCP-1的表达比模型组和扶他林组降低（P＜0.01）。见表1 。

表1 各组小鼠腰椎脊髓MCP-1的表达比较

2.2 血IL-1β水平 经SNK法多重比较显示，IL-1β水平扶他林组和模型组差异无统计学意义，中药外敷组和假手术组差异无统计学意义；其余两两比较，差异具有统计学意义。扶他林组和模型组IL-1β水平比假手术组高（P＜0.05）。中药外敷组IL-1β水平比模型组和扶他林低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠血IL-1β水平比较

2.3 血TNFα水平 经SNK法多重比较显示，TNFα水平扶他林组和模型组之间差异无统计学意义，其他两两比较，差异均具有统计学意义。中药外敷组、扶他林组和模型组TNFα水平均比假手术组高（P＜0.05）。提示肺癌骨转移癌痛小鼠血TNFα水平升高。中药外敷组TNFα水平比模型组和扶他林组低（均P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠血TNFa水平比较

2.4 血IL-6水平 经方差分析，各组小鼠IL-6水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 各组小鼠血IL-6水平比较

3 讨论

骨转移癌痛成因复杂，造成骨质破坏、骨痛、病理性骨折、脊髓压迫、高钙血症等，是晚期骨转移患者最痛苦的症状之一。骨转移癌属中医文献中“骨瘤”、“骨蚀”、“骨疽”、“骨痹”等范畴，《清代外科证治全书》又有“贴骨瘤，贴骨而生，极疼痛”记载。目前中医治疗多以补肾、活血为主[6]。中药外治法为体表直接给药，药力直达病所，止痛迅速有效，且可避免药物内服带来的某些副作用。因此，中药外治骨癌痛更具优势。吴师机《理瀹骈文》云：“外治之理，即内治之理，外治之药，即内治之药，所异者法耳。医理药性无二，而法则神奇变化。”张景岳在《景岳全书·杂证谟·积聚》中云：“凡坚硬之积，必在肠胃之外，募原之间，原非药力所能卒至。宜用阿魏膏、琥珀膏，或水红花膏、三圣膏之类，以攻其外。再用长桑君针法，以攻其内”。对于癌性疼痛的病因，首先表现为局部的占位，阻滞经络气血的实性疼痛，因实致痛。芳香类中药具有走窜定痛的作用，同时其挥发油能促进其他药物透皮吸收，因此在疾病外治中应用广泛。

研究表明，骨癌所触发的初级感觉神经元的兴奋性变化，以及脊髓神经化学变化、细胞重塑是构成其行为痛过敏的物质基础。骨癌导致初级感觉神经元兴奋性异常增加的因素来自两个方面：一是破骨细胞的过度激活；二是肿瘤细胞分泌TNFα、IL-1、内皮素-1等因子。另外肿瘤组织中有20%～30%的巨噬细胞能产生TNFα和IL-1等，二者也均能兴奋初级传入神经元[7-8]。而且骨癌痛动物初级传入神经元受到敏化与骨质破坏程度、肿瘤生长相关。OPG/RANK/RANKL通路是调节破骨细胞的形成和生存的关键途径。在恶性肿瘤的早期阶段，患者骨髓中即可分离出播散肿瘤细胞（disseminated tumor cells，DTCs）[9-10]。DTCs可分泌IL-1、IL-6、MIP1a激活破骨细胞的生成，这些因子与前体破骨细胞表面的核因子κB的受体激活剂（receptor activator of NF-κB，RANK）相互作用可活化下游的许多细胞间的信号通路：NF-κB（nuclear factor-kappa B）、JUN 激酶及CaN/NFAT信号传导通路，这些信号途径的激活促进破骨细胞的生成、成熟和存活。除了促进新生的破骨细胞形成，DTCs还可与骨髓中其他细胞相互作用，加强已存在的破骨细胞中的溶骨性骨吸收作用。DTCs分泌的前列腺素（prostaglandins）、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormonerelated peptide，PTHrP）、 活 化 的 维 生 素 D、IL-6及TNFα可上调成骨细胞及骨基质细胞表面的RANKL表达[11]。Miossec等[12]研究表明：普遍存在于骨髓中的T细胞也可分泌激活破骨作用的因子。DTCs分泌的IL-6、IL-1及 TGF-β可诱导T细胞分化为Th17细胞，该细胞可通过分泌IL-17促进破骨作用并诱导成骨细胞表面RANKL的表达。本研究结果提示，肺癌骨转移癌痛小鼠可见血IL-1β、TNFα水平升高。本团队前期研究显示，芳香类中药外敷不仅促进药物透皮吸收，缓解患者骨转移癌痛[13]。骨癌痛小鼠模型造模成功后第21 d，中药外敷组小鼠缩足反应百分率（23.10±3.38）%比扶他林组（32.70±4.45）%和模型组（52.20±5.61）%少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；中药外敷组热刺激过敏为（14.10±3.68）s，比扶他林组（10.70±3.23）s和模型组（6.90±2.64）s延长，差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明芳香类中药外敷降低骨转移癌痛小鼠机械性痛觉和热刺激痛觉[4]；另外还对骨转移瘤有一定的抑制作用[5]。香辛方可以降低血IL-1β水平和TNFα水平，可能通过下调炎性介质表达起到缓解骨转移癌痛的作用。

文献报道，丁香（油）可明显提高小鼠机械性压痛痛阈值[14]。其有效成分丁香苷对小鼠热板试验、醋酸扭体试验有一定镇痛作用[15]。细辛对抗炎、镇痛具有明确作用[16]，对多种疼痛动物模型具有良好的镇痛作用。与吗啡比较，其镇痛作用起效慢, 但作用时间长[17]。目前，中医外治癌痛的常见机制有，抑制炎性介质，抑制破骨细胞活化，抑制脊髓初级感觉神经元活化，抑制中枢敏化，抑制离子通道等。肿瘤组织及周围的炎性细胞，如巨噬细胞、T淋巴细胞和内皮细胞等，可分泌不同类型的炎性介质，包括TNFa、内皮素-1、IL-1和IL-6等，通过各自的受体，直接或间接致敏初级传入神经元[18]。骨内和周围的初级传入神经元含有独特的蛋白，协助骨癌痛相关的温度，机械性或化学刺激的传导[19]。同时，还涉及其他间接机制，如肿瘤相关免疫调节，骨细胞以及肿瘤微环境中释放的介质诱导温度、机械和化学刺激，随后引起疼痛感受器的激活。同时，本研究结果显示，骨癌痛模型小鼠脊髓MCP-1的表达上调，提示骨癌痛小鼠出现了痛觉中枢敏化，这与以往的研究结果一致。中药外敷方可以使脊髓MCP-1表达下降，抑制中枢敏化而起到止痛作用。有研究发现，在神经病理痛大鼠模型上，背根神经节和脊髓背角的磷酸化蛋白质激酶B阳性神经元显著增加[20-21]。金迪等[22]对骨癌痛大鼠鞘内给予MCP-1中和抗体后，脊髓p-Akt表达降低，并使机械痛阈明显降低，说明脊髓MCP-1可能通过激活PI3K/Akt信号通路参与了大鼠骨癌痛的形成。骨转移癌痛是机制复杂的慢性疼痛，中药复方对骨癌痛的镇痛也是从多环节、多因素来发挥作用的。本方对肿瘤生成的其他分子机制是否仍有抑制作用，我们将在下一步的课题研究中继续深入研究。