HPLC法测定泻痢固肠丸中去氢二异丁香酚的含量

刘东升 朱 琳 苏 蕊 徐继军 姚世霞 朱旭江

1.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，甘肃 兰州 730070

泻痢固肠丸(水丸)处方由元代《丹溪心法》卷六中的古汤方加减，现行标准收载《卫生部药品标准中药成方制剂第四册》[1]，由人参、白芍、肉豆蔻(煨)等九味药组成，具有健脾化湿、益气固肠作用。其中处方中的肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻(MyristicafragransHoutt.)的干燥种仁。具有温中行气、涩肠止泻之功。其主要成分为挥发油和脂肪油以及一些非挥发性的活性成分去氢二异丁香酚，具有较强的抑菌作用。2015年版《中国药典》一部在肉豆蔻单药材项下收录了HPLC法测定去氢二异丁香酚含量的内容[2-7]。但泻痢固肠丸的现行质量标准中没有收载相关的质量标准，为了更好的控制该成药的质量，选择肉豆蔻为研究对象，采用反相高效液相色谱法对肉豆蔻中的化学成分去氢二异丁香酚进行含量测定，方法简便、准确为控制肉豆蔻药材的质量提供很好的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪；德国Sartorius电子分析天平； KQ-500E数控超声波清洗器。

1.2 材料 去氢二异丁香酚对照品(批号：Z09681，上海源叶)；泻痢固肠丸(A厂、B厂)；甲醇(分析纯)；水为超纯水。样品为2017年国抽样品两个厂家14个批次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用试验 色谱柱： Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(70∶30)；检测波长：274 nm；流速为1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：25 μL；理论塔板数按去氢二异丁香酚峰计算应不低于3000，去氢二异丁香酚与其他成分分离度符合要求。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取对照品1.487 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取3 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，称取约0.5 g，置具塞锥形瓶中，加75%甲醇50 mL，精密称定，超声提取30 min(功率500 W，频率40 Hz)，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 精密称取阴性样品粉末约0.5 g, 照供试品溶液的制备项下的方法制备。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性实验 在2.1项下色谱条件下，分别精密吸取对照品、供试品和阴性对照溶液各25 μL进样，记录色谱图。发现阴性对照在与对照品色谱峰相同的保留时间处无干扰，且基线平稳，表明该方法专属性良好。如图1所示。

2.3.2 工作曲线与线性范围 分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20、25、30、35 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，以对照品溶液的浓度(μL/mL)为纵坐标(X)，峰面积积分值为横坐标(Y)作图，得到近过原点的一条直线。计算回归方程：Y=94.79632X+0.72567，r=0.99996。结果表明去氢二异丁香酚对照品在0.3569～6.2454 μL/mL浓度范围内有良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验 取对照品溶液，精密量取25 μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，结果峰面积RSD为0.4%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液(批号：15081397)25 μL，分别于0、4、8、12、18、24 h 6个时间点注入液相色谱仪，测定待测成分峰面积RSD为2.5%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性实验 精密称取同一批号的供试品(批号：15081397)6份，按本标准拟定的方法平行测定，并计算样品中待测成分的含量RSD为1.4%(n=6)，表明供试品溶液重复性良好。

2.3.6 回收率实验 取已知去氢二异丁香酚含量的供试品(批号：15081397)6份，按供试品溶液中去氢二异丁香酚含量的100%精密加入去氢二异丁香酚对照品溶液(浓度为0.004461 mg/mL)10 mL，置具塞锥形瓶中，氮气吹干，精密称取样品约0.25 g于同一锥形瓶中按供试品溶液的制备方法同法处理，并测定其待测成分含量。结果回收率为101.6%，且RSD小于3.0(n=6)。结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.4 含量测定 按上述色谱条件对14批供试品进行测定，结果见表2。A和B两个生产厂家的样品中去氢二异丁香酚含量在0.07～0.32 mg/g之间，数据较为分散，可能跟不同生产厂家生产工艺和原药材质量控制有很大关系。结合限度规定发现只有A生产厂家(批号：150714)的一批样品低于限度规定，可能与生产企业原药材的质量有关。

表2 样品测定结果

3 讨论

3.1 限度规定 根据2015年版《中国药典》一部肉豆蔻项下规定按干燥品计算去氢二异丁香酚(C20H22O4)应不得少于0.10%，考虑药材投入制剂的实际情况，按处方理论量折算，扣除水分，限度确定为：本品含肉豆蔻以去氢二异丁香酚(C20H22O4)计，每1 g不得少于0.022 mg。

3.2 提取溶剂的选择 比较了用甲醇和不同比例的甲醇水溶液(65%、75%和85%甲醇)提取溶剂来提取本品，结果表明用75%甲醇提取比较充分，且出峰时间和峰形比较理想。因此选用75%作为提取溶剂。

3.3 流动相的选择 比较了甲醇-水(70∶30)和甲醇-水(60∶40)、甲醇-0.1磷酸(70∶30)、甲醇-乙酸铵(85∶15) 四种流动相，结果表明去氢二异丁香酚在甲醇-水(70∶30)等度洗脱下出峰时间和峰形理想。因此作为最终的流动相。