无机硒在干酪乳杆菌和啤酒酵母混合发酵过程中的相互作用

王 琨,马成杰,*,胡家勇

(1.光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海 200436; 2.湖北省食品质量安全监督检验研究院,湖北武汉 430023)

硒元素是动物体必需的14大微量营养元素之一,具有抗癌抗氧化、调压保肝、提高机体免疫力的作用,同时其是硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化氢酶等多种蛋白的必需组成部分[1-2]。硒元素的缺乏会引起克山病、大骨节病;然而过量的硒会导致机体中毒,内分泌系统损伤,并抑制生长激素和甲状腺激素合成[3-4]。中国72%以上属于缺硒地区,每人每天日摄入量低于世界卫生组织推荐的最低摄入量50 μg[5]。硒元素在自然界中主要以无机硒和植物活性硒的形态存在,在生物体内不能长期贮存,需要从饮食中摄取来维持平衡[6-7]。传统上是通过无机硒化合物即亚硒酸钠的口服制剂补硒,但其毒副作用强,吸收利用率较低,而生物转化后的有机硒化合物毒性低,并且能够更好地激发机体的免疫作用[8-9]。酵母被认为是富集硒元素的最理想微生物,可以在代谢活动中将无机硒转化为有机或无毒单质形式,且酵母本身含有蛋白质、糖类以及B族维生素等丰富的营养物质,在国外是常规的膳食补充剂[2]。

大量学者对于乳酸菌的富硒能力进行了研究,如鼠李糖乳杆菌、青春双歧杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌等[1-2,7]。对于富硒酸奶的研究相对较少:郑文玮等[10]以富硒酵母为原料来加工酸乳,但富硒酵母本身即为保健产品,用于工业生产成本较高;张蓉等[4]和刘东等[11]通过制备富硒的酸奶发酵剂,进一步制作富硒酸奶,而发酵剂的添加量限制了产品的硒含量,且工序较为复杂。目前还没有利用益生菌直接发酵含有无机硒的牛乳的相关报道。

乳制品已成为人们日常饮食的一部分,经过发酵后的乳制品不仅能够将益生菌带入人体内环境,同时添加的功能性物质也能够进入人体起到保健作用。本实验将富硒能力强的啤酒酵母与干酪乳杆菌相结合，使益生菌在发酵过程中直接利用无机硒,探究不同硒浓度与二者混合发酵复原乳的相互作用,测定发酵产品的抗氧化能力变化,并且对混合发酵过程中无机硒的转化水平进行检测,以期将乳制品与硒剂相结合,为开发有效并且方便的硒补充剂提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干酪乳杆菌LC2W(CGMCC No.0828) 光明乳业研究院;啤酒酵母 安琪酵母股份有限公司;琼脂、蛋白胨、酵母粉 OXIOD有限公司;脱脂乳粉 恒天然有限公司;亚硒酸钠、DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、Trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic aci,6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)、吐温-80 SIGMA有限公司;MnSO4·H20、MgSO4·7H20、K2HPO4·3H20、乙酸钠、柠檬酸二铵、牛肉粉、葡萄糖、氢氧化钠、乙醇 国药集团;硝酸 Merck公司;超纯水(MQ水) 自制;YPD培养基、MRS培养基自行配制[2,7]。

RW20搅拌器 德国IKA;Bugbox厌氧工作站 英国Ruskinn;MIR-253恒温培养箱 日本三洋;UV-1800紫外可见分光光度计 日本岛津;YX-280D高压蒸汽灭菌锅 合肥华泰;超净工作台 美国Labconco;8800 ICP-MS/MS电感耦合等离子体质谱仪 安捷伦;FE20K pH计、ME203/02电子天平、ME2002E/02电子天平梅特勒-托利多仪器 (上海)有限公司;优普UPT-I-5超纯水机 西安优普仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复原乳的制备 将脱脂乳粉溶解在蒸馏水中,搅拌混合均匀,配制成12%(w/w)浓度,分装100 mL于150 mL三角瓶中,置于高压蒸汽灭菌锅内115 ℃灭菌5 min,冷却备用。测定pH为6.50。

1.2.2 菌种活化 根据王刚及曾议霆的试验方法[7,12]稍作改动。干酪乳杆菌种子液制备:将干酪乳杆菌冻干粉用5 mL 馏水溶解,用接种环划线于MRS固体培养基37 ℃厌氧培养24 h,用接种环挑取单菌落放入5 mL MRS液体培养基活化,37 ℃厌氧培养12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液体培养基中扩大培养,37 ℃厌氧培养24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃离心10 min,弃去上清,菌体用无菌生理盐水洗涤2次后,用无菌生理盐水调节菌体浓度至OD600=0.7,种子液浓度约为108CFU/mL备用。

啤酒酵母种子液的制备[2,8]:将啤酒酵母的冻干粉分别用5 mL无菌蒸馏水溶解,用接种环取一环划线于YPD固体培养基上,30 ℃厌氧培养24 h取出,用接种环挑取单菌落放入5 mL YPD液体培养基,30 ℃厌氧培养12 h。吸取0.2 mL活化后的菌液置于100 mL MRS液体培养基中扩培,30 ℃厌氧培养24 h。菌液于8000 r/min、4 ℃离心10 min,弃去上清,菌体用无菌生理盐水洗涤2次后,用无菌生理盐水调节菌体浓度至OD600=0.1,种子液浓度约为106CFU/mL备用。

1.2.3 硒发酵液的配制及发酵 根据曾红等[13]的试验方法做改动。在灭菌后的复原乳中加入亚硒酸钠溶液,震荡使其充分混合,使得亚硒酸钠的终浓度分别为0.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。

将四种浓度的发酵液分别接种干酪乳杆菌和酵母菌种子液,使得终浓度分别为107和105CFU/mL。置于37 ℃恒温培养箱厌氧发酵12、24、36、48 h并于各时间点取样后冷却至10 ℃以下备用。

1.2.4 pH检测 用pH计检测各组样品在12、24、36、48 h的pH。

1.2.5 益生菌数量检测 根据Li等[14]的试验方法,将发酵好的加不同硒含量的发酵组及对照组混合均匀后分别准确称取1 g,用无菌生理盐水梯度稀释至适宜浓度,分别用MRS和YPD培养基进行平板倾注法计数,凝固后分别置于37 ℃恒温培养48 h,每组做三个平行,分别测定12、24、36、48 h的菌数,每组做三个平行,将平均值以10为底取对数作图。

1.2.6 硒转化率的检测 参考刘嘉坤等[15]和曾议霆等[7]的试验方法,并且稍作改动。微波消解:准确称取约0.4000 g试样于聚四氟乙烯消解管中,加10 mL硝酸进行微波消解。微波消解程序设置如下:温度爬坡10 min升温至120 ℃,温度保持5 min;温度爬坡10 min升温至190 ℃,保持20 min;冷却25 min降温至55 ℃。冷却后取出,缓慢打开罐盖排气,将消解罐放在控温电热板上或超声水浴箱中,于100 ℃加热30 min或30 ℃ 4000 W超声脱气2～5 min,用超纯水定容至25或50 mL,混匀备用,同时用超纯水做空白试验。

仪器条件:射频功率为1500 W;等离子体气流量15 L/min;载气量0.8 L/min;辅助气流量0.40 L/min;雾化室温度2 ℃样品提升速率0.3 r/s;采样深度8～10 nm;重复三次。

别稀释标准硒溶液至4、8、12、16、20 μg/L,依次上机测定,采用内标法定量,仪器自动完成校正曲线。将各时间点的发酵液离心取上清液,分别用0.22 μm滤膜过滤,过滤好的上清样品按照以上测定方法上机进行测定,仪器根据校正曲线自动给出硒含量。将各时间点的发酵液离心取上清液,分别用0.22 μm滤膜过滤,过滤好的上清样品上机后利用校正曲线进行含量测定。转化的硒含量通过发酵前原料液的硒含量减去上清中无机硒含量获得,即

转化率(%)=(1-上清中硒含量/硒添加量)×100

1.2.7 抗氧化性检测 参考Li等[14]稍做改动,将各时间点加硒组及对照组分别经10000 r/min、4 ℃离心10 min,上清用0.22 μm滤膜无菌过滤器过滤备用。取0.1 mL待测加硒组及对照组样品于3.9 mL DPPH溶液中(DPPH母液10稀释倍),混合均匀后室温下避光反应30 min,以无水乙醇调零,在517 nm波长下测定吸光度A1,以无水乙醇代替样品作为空白组测定吸光度A0,DPPH清除率计算如下:

清除率(%)=(1-A1/A0)×100

将Trolox标准溶液梯度稀释为5、10、20、40 mg Trolox/L溶液,以Trolox浓度为横坐标,清除率为纵坐标做清除率标准曲线,并得到半清除率(IC50)所对应的Trolox值。将各组发酵液以及过滤除菌后的上清液分别按照上述方法测得IC50,用Trolox当量(Trolox E-quivalent Antioxidant Capacity,TEAC,即每克抗氧化物质的自由基清除能力相当于Trolox的值)衡量各组样品的抗氧化性。

1.3 数据处理

图中数据采用Excel 2007进行处理，每组做三次平行，表示为均值±标准差，同时应用SPSS 20.0统计软件进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 亚硒酸钠和发酵时间对发酵液pH的影响

如图1所示,随着发酵时间延长,发酵液的pH均逐步下降,相同发酵时间内不同硒浓度的pH无显著差异。说明亚硒酸钠的添加对干酪乳杆菌和酵母菌产酸能力的抑制作用不明显。

图1 亚硒酸钠浓度和发酵时间对pH的影响Fig.1 Effects of different concentration of sodium selenite and fermented time on pH注:不同字母表示显著差异(p<0.05);图5同。

2.2 亚硒酸钠和发酵时间对益生菌数量的影响

如图2所示,不同硒添加量的发酵液中干酪乳杆菌数量随发酵时间延长呈现先增后降的趋势,菌数均在36 h达到峰值,硒添加量从低到高的菌数分别为4.27×109、3.06×109、2.84×109、2.25×109CFU/g,未添加硒元素的发酵液中干酪乳杆菌数量高于添加硒元素的发酵液,而随着硒剂浓度的升高,对干酪乳杆菌的增殖起到了明显的抑制作用。在朱俊辰[16]研究表明嗜酸乳杆菌在添加亚硒酸钠后生长缓慢,延滞期变长,对数期缩短,且未添加亚硒酸钠的菌数量均高于硒剂组,与本实验结果相同。而燕卫东[17]对保加利亚乳杆菌对硒耐受能力的实验中发现,4 mg/L的亚硒酸钠对菌种增殖有促进作用。

如图3所示,啤酒酵母菌数亦呈现先增后降的趋势,10 mg/kg亚硒酸钠的发酵液在24 h达到峰值;其他各组均在12 h达到峰值,其中2 mg/kg硒酸钠的发酵液高于其他各组,可见2 mg/kg亚硒酸钠对酵母菌的增殖有促进作用。

图3 亚硒酸钠浓度和发酵时间对酵母菌数量数量的影响Fig.3 Effects of concentration of sodium selenite and fermentation time on Saccharomyces cerevisiaecount

2.3 发酵液的硒转化率检测

未添加硒元素的上清中硒含量为0,添加硒元素的发酵液随着发酵时间延长上清中硒含量不断降低在发酵24 h内,发酵液硒转化率较快,24 h以后达到98%以上并趋于平缓(图4)。在0～12 h之间,2 mg/kg剂量组转化最快,其次是5 mg/kg亚硒酸钠的发酵液。在12～24 h之间,10 mg/kg亚硒酸钠的发酵液转化率变快,超越了其他两组。

图4 加硒组的硒转化率Fig.4 Selenite conversion rate of selenium added groups

2.4 亚硒酸钠添加量和发酵时间对发酵液抗氧化能力的影响

如图5A所示,随亚硒酸钠添加量的增加,相同发酵时间下各实验组上清液抗氧化能力逐渐减弱,发酵24 h时,相较无外源添加硒元素发酵液,其他各组上清液的抗氧化能力随硒浓度升高而显著降低;发酵36 h时,除10 mg/kg亚硒酸钠添加量的发酵液的上清液外,其抗氧化能力无显著差异;48 h时实验组上清液抗氧化能力无显著差异。硒剂添加组在24 h上清抗氧化性比未添加组)显著下降,未添加硒元素的上清液抗氧化性均维持在较高水平,24 h后出现小幅下降。研究表明乳酸菌菌体、胞内物质及胞外代谢产物(如胞外多糖),均有一定的抗氧化性[18-19]。结合2.2结果分析,无外源添加硒元素干酪乳杆菌增殖快,胞外代谢产物积累速率高,使得其上清中的抗氧化性维持在较高水平,添加硒元素之后菌数增殖慢,但在24 h前菌株对硒元素转化率高,使得上清液中的硒含量降低的,因此24 h时上清的抗氧化性降低;48 h的菌数逐渐降低,上清中有害代谢产物积累,抗氧化性下降。

图5 亚硒酸钠和发酵时间对抗氧化能力的影响Fig.5 Effects of co ncentration of sodium selenite and fermentation time on antioxidant ability 注:A:上清液的抗氧化能力;B:总抗氧化能力; C:除去上清后干物质抗氧化能力。

如图5B,随发酵时间延长,除添加10 mg/kg亚硒酸钠的发酵液外,总抗氧化能力不断升高;在相同发酵时间内,亚硒酸钠低添加量(2 mg/kg)的发酵液抗氧化能力显著低于高添加量(5、10 mg/kg),可见亚硒酸钠的添加增加了发酵液的抗氧化能力。

将总抗氧化能力与上清液抗氧化能力做差值得到干物质的抗氧化能力(图5C),即排除上清中未被转化的亚硒酸钠,可见干物质的抗氧化能力随硒添加量升高而上升,且添加亚硒酸钠的发酵液抗氧化能力主要来源于发酵后的干物质,而未添加亚硒酸钠的发酵液上清液的抗氧化能力达到50%以上。由于发酵液中的亚硒酸钠被微生物转化利用,转化为有机硒或单质硒,使得发酵乳干物质的抗氧化能力显著提高。

3 结论

本研究以添加无机硒的复原乳为原料,利用啤酒酵母和干酪乳杆菌协同发酵,研究发现不同浓度的亚硒酸钠在相同发酵时间内对干酪乳杆菌产酸能力的抑制作用不显著,而对干酪乳杆菌的增殖有一定的抑制作用,且浓度越高,抑制作用越明显。其对啤酒酵母的增殖并无显著抑制,相反,2 mg/kg的亚硒酸钠对啤酒酵母的增殖产生了促进作用。在发酵过程中,亚硒酸钠的生物转化率在发酵前24 h不断升高,之后趋于平稳,其中2 mg/kg剂量组转化最快;随亚硒酸钠浓度不断增加,其抗氧化能力不断提高,发酵乳的总抗氧化能力和除去上清的固体物质抗氧化能力均不断上升。综合考虑pH,益生菌数量以及硒转化率结果,在添加2 mg/kg的亚硒酸钠发酵24 h时,发酵乳性能较好。本研究为含硒的功能性乳品的开发提供了一定的理论基础。