硫化钠提取人发角蛋白研究

王倩倩, 张 林,2,王泉泉, 刘 云, 刘 杰, 朱 平, 江 南

(1.青岛大学 纺织服装学院/功能纺织品与先进材料研究院/纤维新材料及现代纺织国家重点实验室培育基地/海洋生物质纤维材料及纺织品山东省协同创新中心,山东 青岛266071;2.山东洁晶集团,山东 日照 276826;3.青岛莱茵纺织材料有限公司,山东 青岛 266109)

0 引 言

作为一种具有优良性能和优异应用效果的天然聚合物，角蛋白具有广泛的来源，可以从动物的毛发、羽毛、蹄和角中提取[1-3]。我国每年会剪掉上万吨的头发，其中只有少部分具有足够长度的人发用来制作高效益的假发，其余的大多被丢弃。人发中角蛋白含量高达95%，而角蛋白作为人发的主要成分，其结构中存在许多二硫交联键，尤其在人发鳞片层中存在高交联的二硫键，使得人发难以溶解和自然降解[4-6]。

当硫化钠用于处理人发时，它起到还原剂的作用，以破坏人发角蛋白中的二硫键。同时，通过水解形成的氢氧化钠破坏角蛋白分子中的化学键，例如二硫键和肽键，有助于人发充分地溶胀进而溶解[7]。由于氢氧化钠能使肽键发生水解，所以产物分子量较小。因此，可以添加其他试剂作用于蛋白质分子间的氢键和离子键，降低硫化钠的用量，从而减小肽键的破坏程度，保护大分子链的完整性。SDS不仅在一定程度上抑制人发蛋白质分解产生的半胱氨酸的氧化作用，而且其可以破坏蛋白质分子的二硫键和氢键，促进人发纤维的溶解[8-9]。文中选择加入十二烷基硫酸钠(SDS)和尿素来辅助溶解，借助它们对人发的溶胀作用，进而有效促进人发无限溶胀而溶解。

1 实 验

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 废弃人发(理发店随机取样)；透析袋(截留分子量为3 000 Da，上海金穗生物科技有限公司)。

1.1.2 试剂 硫化钠(Na2S·9H2O，上海统亚化工科技发展有限公司)，尿素(天津市巴斯夫化工有限公司)，十二烷基硫酸钠(SDS，天津博迪化工股份有限公司)，均为分析纯。

1.1.3 仪器 BS110S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；HH数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)；101A-28电热干燥箱(上海市实验仪器总厂)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器)；Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪(美国Thermo Fisher公司)； DX2700型X射线衍射测试仪(丹东浩元仪器有限公司)；TGD/STDA851e型热重分析仪(瑞士METTLER-TOLEDO公司)。

1.2 人发角蛋白提取工艺

将废弃人发洗净剪成长度约为1 cm的碎发段。准确称取1 g人发，并加入10 mL Na2S·9H2O、SDS和尿素混合溶液中。密封加热，分别做不同硫化钠用量、不同溶解时间和不同溶解温度的单因素对比实验。保证人发要完全浸没在溶液中，每30 min搅拌1次，防止头发黏附在试管壁上或聚集成团，影响溶解效果。溶解完成后过滤，烘干残渣称重。将滤液离心，将上清液透析48 h(每12 h更换蒸馏水)，干燥，得到角蛋白粉末。

1.3 测试方法

用式(1)计算人发纤维溶解率(S)

(1)

式中:m0为人发纤维初始质量(g)；m1为滤布质量(g)；m2为烘干的不溶物和滤布的总质量(g)。

用式(2)计算人发角蛋白提取率(T)

(2)

式中:m3为烧杯质量(g)；m4为烘干的人发角蛋白和烧杯的总质量(g)。

1.3.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR) 首先，将人发纤维研磨成粉末，然后通过溴化钾压片法将人发粉末和角蛋白粉末压片。使用Nicolet 5700型傅里叶变换红外光谱仪测试人发纤维和人发角蛋白粉末的红外光谱曲线。扫描范围400～4 000 cm-1，数据点间隔1.285 8 cm-1。

1.3.2 X射线衍射分析(XRD) 采用DX2700型X射线衍射测试仪，测试人发纤维和人发角蛋白的晶体结构。测试条件：扫描范围5～50°，扫描速度2°/min，辐射源Cu靶Kα (λ=15.405 nm,40 kV,30 mA)。

1.3.3 热重分析(TG) 利用TGD/STDA851e型热重分析仪，测试人发纤维和人发角蛋白的热稳定性。测试条件：氮气氛围下，升温速率为10 ℃/min，温度范围为50～800 ℃。

2 结果与讨论

2.1 人发角蛋白的提取工艺

2.1.1 硫化钠用量的影响 控制溶比为1∶10，SDS质量浓度10 g/L，尿素质量浓度2 g/L，溶解时间3 h和溶解温度90 ℃，分析不同硫化钠质量浓度对人发纤维溶解率的影响，结果如图1所示。

图 1 硫化钠用量对人发纤维溶解率的影响

由图1可知，当硫化钠的质量浓度为60 g/L时，人发纤维溶解率高达99.28%。随着硫化钠用量的增加，人发纤维溶解率显著增大，且硫化钠用量越高，人发纤维的溶胀和破坏越明显，溶解反应越剧烈。人发角蛋白在溶解过程中会生成不同分子量的产物，有高分子量的蛋白质长链，也有低分子量的多肽[10-11]。但是角蛋白的分子量过小就会降低人发角蛋白的提取率，因此不仅要追求高溶解率，也要兼顾提取的角蛋白分子量。因此综合考虑，本实验Na2S·9H2O用量为60 g/L。

2.1.2 溶解温度的影响 控制浴比1∶10，Na2S·9H2O质量浓度60 g/L，SDS质量浓度10 g/L，尿素质量浓度2 g/L，溶解时间3 h,分析温度对人发纤维溶解率的影响,结果见图2。

图 2 溶解温度对人发纤维溶解率的影响

由图2可知，在温度低于60 ℃时， 人发纤维溶解率的增长趋势缓慢， 且溶解率明显低于70%；当温度逐渐升高时， 人发纤维溶解率的增长速率显著增加。这是因为，当温度低于60 ℃时，人发表面的鳞片层起到了良好的保护作用；当温度高于60 ℃时， 硫化钠对人发鳞片层的破坏性加剧，增加了与人发纤维内部化学键的接触，从而加速了人发的溶胀和角蛋白分子链的分解。然而，高溶解温度倾向于水解破坏角蛋白， 其大分子长链容易水解成小分子甚至是多肽，从而降低角蛋白的提取率[6,12]。 出于对节约能源和成本的考虑，此实验溶解温度选择80 ℃。

2.1.3 溶解时间的影响 控制浴比1∶10，Na2S·9H2O质量浓度60 g/L，SDS质量浓度10 g/L，尿素质量浓度2 g/L，温度90 ℃,分析溶解时间对人发纤维溶解率的影响,结果见图3。

图 3 溶解时间对人发纤维溶解率的影响

Fig.3 Effect of dissolution time on the dissolution rate of human hair fiber

由图3可以看出，当溶解时间仅为15 min时，人发纤维的溶解率就已经高达77.09%；当溶解时间在45 min～90 min内时，溶解率显著增大并且达到了95.79%；当时间增大到120 min，溶解率高达98.38%，溶解速率趋于平缓。所以，再延长溶解时间会增加角蛋白大分子长链的断裂和分解，导致人发角蛋白的提取率下降。因此，此实验选择溶解时间为120 min。

2.2 人发角蛋白提取实验分析

在溶解的最优条件下，即硫化钠质量浓度为60 g/L，溶解温度为80 ℃，溶解时间为120 min，同时进行3组平行实验。将得到的人发角蛋白溶液在蒸馏水中透析48 h，干燥12 h后得到提取的人发角蛋白，并按照式(2)计算人发角蛋白的提取率,结果见表1。由表1可以看出，人发角蛋白提取率的平均值为62.98%，提取率较高。

表 1 人发角蛋白提取率

2.3 红外光谱分析

人发纤维和人发角蛋白的红外测试结果见图4。蛋白质内的特征化学键主要是肽键(—CONH—)。由图4可知，人发纤维和提取的人发角蛋白的红外光谱都具有明显的酰胺A、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ等特征[13-15]，都属于典型的蛋白质类谱图。人发纤维在1 076 cm-1处出现吸收峰，是由S—O对称伸缩振动引起的，归属于胱氨酸—氧化物，说明人发纤维中存在一定的胱氨酸氧化产物。提取的人发角蛋白在1 039 cm-1处出现吸收峰，归属于磺基丙氨酸，说明人发纤维在溶解过程中，人发角蛋白的二硫键被破坏和氧化，相应地生成磺 基丙氨酸[16-17]。

人发纤维和人发角蛋白的特征吸收峰的振动模式如表2所示。由表2可知，与人发纤维相比，角蛋白在酰胺Ⅱ带和酰胺Ⅲ带吸收峰的位置发生了明显的变化。这是由于在溶解过程中，角蛋白大分子链上化学键的断裂所造成的。在酰胺I带的谱峰中，1 658～1 650 cm-1为α-螺旋，1 640～1 610 cm-1为β-折叠[16-20]。人发纤维和人发角蛋白酰胺I带的特征峰都在1 654 cm-1附近，表明它们都含有α-螺旋和β-折叠结构。

表 2 人发纤维和人发角蛋白的FT-IR特征谱带

图 4 人发纤维和人发角蛋白的FT-IR谱图Fig.4 Infrared spectra of human hair fiber and human hair keratin

2.4 XRD分析

利用X射线衍射分析人发纤维和人发角蛋白的晶型结构，结果见图5。由图5可知，与人发纤维的XRD衍射曲线相比，人发角蛋白的晶型结构发生了改变。人发纤维中在10.17°的弱衍射峰，在人发角蛋白中偏移到10.13°的位置；而人发纤维在21.02°处的衍射峰，在提取的人发角蛋白中偏移至20.78°的位置，同时衍射峰的强度都有所降低。这是因为位于10.13°和10.17°处的衍射峰对应的晶型为α-螺旋和β-折叠，位于20.78°和21.02°的衍射峰对应的晶型为β-折叠[21-23]。可以推测，人发角蛋白X射线衍射曲线的变化是由于溶解过程对氢键的破坏作用较大，导致部分α-螺旋和β-折叠晶体结构被破坏。

图 5 人发纤维和人发角蛋白的XRD衍射曲线

2.5 热重分析(TG)

通过TG考察提取的人发角蛋白和人发纤维的热稳定性，结果见图6。由图6可知，它们的热分解过程可分为2个阶段。第一阶段在50～170 ℃之间，此阶段人发角蛋白和人发纤维的失重率分别为7.52%和9.12%，这主要是因为它们内部含有的水分在升温过程中蒸发了；第二阶段在170～520 ℃之间，由DTG曲线可以看出，它们的失重速率很大，分别在292 ℃和320 ℃时达到最大值，这一阶段主要是蛋白质内部大分子结构受热产生的熔融分解，失重率分别为65.80%和62.33%[7,24-27]。人发角蛋白在252 ℃和265 ℃出现了2个弱峰，失重率分别为6.35%和3.96%；而人发纤维分别在253 ℃和283 ℃出现了2个弱峰，失重率为6.39%和9.86%，这是由于α-螺旋和β-折叠结构熔融分解而形成的峰。由于在溶解角蛋白时破坏了大分子内部的二级结构，所以人发角蛋白在这两段的失重率远小于人发纤维的。当温度高于520 ℃时，人发角蛋白和人发纤维的质量损失都较小，说明它们在520 ℃时已经基本分解完全。

(a) TG曲线

(b) DTG曲线图 6 人发纤维和角蛋白的TG、DTG曲线

3 结 论

(1) 硫化钠体系溶解和提取人发纤维的优化工艺条件为：Na2S·9H2O质量浓度为60 g/L，SDS质量浓度为10 g/L，尿素质量浓度为2 g/L，溶解时间为120 min，溶解温度为80 ℃，浴比1∶10。

(2) 在上述条件下，人发角蛋白的溶解率为92.29%，角蛋白的提取率为62.98%。

(3) TG、XRD和FT-IR结果显示,获得的角蛋白热稳定性良好，其所含的晶型结构和特殊官能团与人发纤维中的基本相同。