不同干燥条件的三七中三七素含量的测定

宋建平，娄 洁，张志信，梁 教

（文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099）

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]为五加科人参属多年生草本植物，是我国传统珍贵中药材，为云南省文山州道地药材。三七饮片具有“散瘀止血，消肿定痛、益气活血的功效。用于跌扑肿痛、内外出血、气虚血瘀、脉络瘀阻、胸痹心痛、中风偏瘫，气虚体弱；软组织挫伤、出血性疾病、高血压、冠心病、脑卒中、高脂血症、糖尿病血管病变、免疫功能低下见上述证候者”[1]。传统中医认为三七有生、熟用药之分及“生打熟补”，生三七用于止血祛瘀、消肿止痛，熟三七主要用于补血、补气。有学者研究认为，三七的生熟之分主要是炮制过程中三七中的各种化学成分含量、结构、比例均发生改变而引起[2]。三七素是三七中存在的一种特殊的水溶性氨基酸，其化学名为β-草酰-L-α，β-二氨基丙酸，1981年日本学者首次从三七中发现将其命名为三七素。药理研究证明，三七素能明显缩短凝血时间、凝血酶原时间和凝血酶时间，提高血小板数和黏附率，增强血小板的功能，起到止血的作用[3]。三七的干燥方法传统上采用自然晾晒，近年来随着产量增加采用快速烤房干燥的三七量已占绝大多数。对三七中皂苷在不同干燥条件下的变化研究较多，但对三七素的影响尚未见报道。基于三七素有一定的神经毒性，在干燥阶段是否对其含量有影响，对三七饮片的深度开发有指导意义。

1 材料与仪器

1.1 材料

鲜三七：购买于云南省文山州三七国际交易市场；冷冻干燥三七（文山华信三七股份有限公司、云南省文山市华信三七加工厂加工处理；生产批号：1601001；生产日期：2016/01/06）；三七素标准品（合肥博美生物科技有限责任公司，纯度＞98%、BZP1872）；甲醇（色谱级，Sigma公司）；超纯水（娃哈哈矿泉水）。

本实验所用鲜三七均来源于云南省文山州，采收期为2017年12月。经过不同的干燥方式干燥处理而成（冷冻干燥三七除外，下同），样品信息见表1。

表1 样品采集信息

1.2 仪器

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色谱仪（德国赛默飞公司）；101型电热鼓风干燥箱（四川中智旗云通用设备有限公司）；高速万能粉碎机FW135型（北京市永光明医疗仪器厂）；ISO-9001型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；80-2型低速台式离心机（金坛市大地自动化仪器厂）；SK-18TC超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；W201D数显恒温水浴锅（上海申顺生物科技有限公司）；津腾尼龙66（Nylon）0.22um微孔滤膜；医用注射器；移液枪（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。

2 方法与过程

2.1 液相条件

Thermo SCINTIFIC U3000型高效液相色谱仪，SyncronisC18（150 mm×4.6 mm，5 um）色谱柱；流动相为：甲醇—（0.1%磷酸）∶水（85∶15）；等度洗脱15 min；体积流量1 mL/min；进样量2 µL；柱温25 ℃；检测波长213 nm。

2.2 三七素含量测定方法

2.2.1 标准溶液的制备

精密称取三七素标准品（相对分子质量为176.13）0.0050 g于150 mL烧杯中，加入一定量超纯水，超声处理使其完全溶解，定容于25 mL容量瓶中，摇匀，制成浓度为0.2 mg/mL的标准品储备液。

2.2.2 标准曲线的绘制

设置序列进样量为 1 µL、2 µL、4 µL、6 µL、8 uL、10 µL的标准品溶液（对应浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 µg/µL），依次进样按照 2.1的色谱条件测定三七素的峰面积值。以峰面积值（y）对样品量（x）进行线性回归，如图1，得线性回归方程为：y=21.257x+0.2325,得到R2=0.9999。由图1可知：三七素的样品量在0～2.0 µg范围内与峰面积值呈良好的线性关系。

图1 三七素标准曲线

2.2.3 样品的处理

将新鲜三七清洗，去除须根，再切片。按表2的干燥方式进行处理，再将不同干燥方式下得到的三七放入高速万能粉碎机粉碎，得到三七干燥粉末。

称取不同干燥方式的三七粉末1.0000 g（详细称取信息见表2），放于具塞锥形瓶中，料液比为1∶10（g∶mL），加入蒸馏水10 mL，在功率为750 W，频率为25 kHz,水浴温度为25 ℃的超声清洗器中超声15 min连续提取2次，将滤液全部转移至离心管中，以3 500 r/min的转速离心15 min，合并两次上清液于40 ℃的恒温水浴锅浓缩20 min，再将其转移至25 mL的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度线，得到该系列的三七素提取液。

首先，取适量该系列三七提取液于定性滤纸上，再加入2滴4%茚三酮溶液，进行显色反应[4]；其次，用注射器取适量的三七素提取液过0.22 µm微孔滤膜，装入进样瓶中，并做好标记；最后，将处理好的样品置于进样盘上进行含量测定。

表2 样品的称取质量

2.2.4 茚三酮显色剂的配制

精确称取苯并戊三酮2.0000 g，用蒸馏水溶解转移到50 mL容量瓶中并定容至刻度线。

2.2.5 内标法的制作

用移液枪移取等量的三七素标准溶液与样品液1于同一装样瓶中，超声3 min后按照2.1中液相条件进行三七素含量的测定。

3 实验结果与结论

3.1 标准品的HPLC图

标准溶液的HPLC如图2所示

图2 标准溶液的HPLC图

3.2 三七素的保留时间

实验得到样品与三七素标准品的保留时间对比图，如图3所示，最上为标准品，1～8号依次从上往下，进行对比可知，保留时间都在1.5 min。

图3 1～8号样品与标准品中三七素的HPLC图

3.3 内标实验的结果

将1号样品、标准品、加内标的1号样品HPLC的峰面积进行对比，如图4所示，1.5 min处的峰由上到下依次为：1号样品、加内标的1号样、标准品的三七素峰。

图4 1号样品、标准品、加内标的1号样品的HPLC图

3.4 三七素含量测定的实验结果

由测得的三七素峰面积按照线性回归方程为：y=21.257x+0.2325进行计算，结果如表3所示。

表3 三七素的含量

4 结论

本实验采用低温超声提取，离心分离得到三七素粗提液，克服了分离难的问题，又避免了三七素受到高温作用而可能发生的变性问题。用HPLC法测定不同干燥条件的样品粗提液中三七素的含量。

实验结果表明，在相同的提取方法下，不同的干燥温度并未发现三七素的含量呈线性变化，40 ℃烘干和日光自然晒干条件下三七的含量最低，而在烘箱干燥50 ℃条件下三七素的含量最高。可能与温度较低时干燥的时间需要更长，三七中的酶对三七素有一定的分解作用有关。

本实验中，因为提取的样品没有经过分离纯化，在三七素粗提液中含有较多的杂质，所以粗提液要放置3 d之后再进行测定。此时粗提液中的其它杂质物质会沉降下来，在经过微孔滤膜的过滤可以使原本溶于水而沉降出来的杂质与三七素分离。实验所用的液相条件对三七素的色谱峰与其余杂峰达到很好的分离效果。