艾纳香中绿原酸类化学成分研究

元超 王鸿发 胡璇 陈晓鹭 庞玉新

摘  要  为全面了解海南传统黎药艾纳香抗菌药效物质基础，本研究采用硅胶柱色谱、凝胶色谱以及高效液相色谱技术对艾纳香提取物进行系统化学成分研究。结果显示：共分离鉴定6个绿原酸类成分：3，5-O-二咖啡酰奎尼酸乙酯（1），3，5-O-二咖啡酰奎尼酸甲酯（2），3，4-O-二咖啡酰奎尼酸甲酯（3），3，4-O-二咖啡酰奎尼酸（4），3，5-O-二咖啡酰奎尼酸（5），1，3，5-O-三咖啡酰奎尼酸（6）。化合物1～6均为首次从该植物中分离得到，其中化合物1为新天然产物。抗细菌活性评价显示化合物3对枯草芽孢杆菌及化合物6对金黄色葡萄球菌均具有较强抑制活性，MIC值均为64 ?g/mL，推测绿原酸类为艾纳香的重要抗菌活性组成。

关键词  艾纳香;抗菌;绿原酸

中图分类号  R284      文献标识码  A

Abstract  To comprehensively investigate the antimicrobial components of Blumea balsamifera （L.） DC.， a traditional Li Minority herb， various chromatographic methods including silica gel， sephadex LH-20 and ODS-A gel were used to study its chemical constituents. Six isolates including 3，5-O-dicaffeoylquinic acid ethyl ester （DAEE）， 3，5-O-di caffeoylquinic acid methyl ester （DAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid methyl ester （OAME）， 3，4-O-dicaffeoylquinic acid （DA1）， 3，5-O-dicaffeoylquinic acid （DA2） and 1，3，5-tri-O-caffeoylquinic acid （DA3） were obtained on the basis of detailed spectroscopic analysis. All compounds were isolated from the plant for the first time， and DAEE is a new natural product. Antimicrobial assay exhibited that OAME and DA3 displayed potent inhibitory activity against Bacillus subtilis （DSM 1088） and Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）， respectively， with MIC value 64 ?g/mL， suggesting chlorogenic acids maybe the main active ingredients of Blumea balsamifera （L.） DC.

Keywords  Blumea balsamifera （L.） DC.; antibacterial; chlorogenic acids

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.020

艾納香[Blumea balsamifera （L.） DC.]为菊科（Compositae）艾纳香属（Blumea）多年生草本植物，为药典中艾片的唯一来源植物[1]。其味辛、微苦、性温、气香，具温中活血，消炎镇痛，祛风消肿等功效[2]，能够治疗风湿关节炎、湿疹、皮肤瘙痒等症[3]，作为传统黎药还被煮水用于妇女产后沐浴[4]。艾纳香中主要成分为挥发油、黄酮类和萜类，目前从事艾纳香非挥发性化学成分研究的主要包括广西师范大学的朱廷春[5]，上海交通大学的陈铭[6]，深圳海王药业的严启新和谭道鹏等[7-8]，以及日本的Osaki等[9]和Osamu等[10]，共报道化学成分50多种，其中黄酮类32种，倍半萜类15种。已有研究对艾纳香中的黄酮和萜类成分方面报道较多，相关生物活性主要集中在抗炎活性、细胞毒活性、血浆酶抑制活性等几个方面，目前艾纳香中绿原酸类成分尚未见研究报道。

绿原酸（chlorogenic acid）类化合物为金银花的主要活性成分[11]，又称咖啡酰奎尼酸 （caffeoy quinic acid）类化合物，是一类由奎尼酸和不同数目的咖啡酸通过酯化反应缩合而成的酚酸类天然化合物，根据奎尼酸上不同位置取代咖啡酰基数目的不同形成一系列的衍生物，具有广泛的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗微生物作用，酶抑制活性，肝保护及抑制血小板凝聚等[12]。

艾纳香作为具有较好抗菌活性的传统黎药在海南黎族百姓中被广泛应用，而通常一种药用植物中的化学成分至少都在100种以上，目前对艾纳香的化学成分方面的研究报道的化合物数量仅50余种，远未达到其实际含有化学成分总量。为进一步阐明艾纳香作为传统抗菌药物的功效物质基础，本课题组拟在前人研究基础上对艾纳香中除黄酮类和萜类之外的非挥发性成分进行系统研究，以期从中发现其他结构类型抗菌先导化合物，为阐明艾纳香的传统药用功效物质基础提供借鉴。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试材料  艾纳香为2017年采自于海南省儋州市艾纳香种质资源圃，经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所庞玉新研究员鉴定为菊科艾纳香属植物艾纳香Blumea balsamifera （L.） DC.，标本保存于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药室。

供試细菌菌株：Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799），Escherichia coli （DSM 1116） 和 Bacillus subtilis （DSM 1088） 均由青岛大学药学院李刚老师提供。

1.1.2  仪器与试剂  核磁共振波谱仪（Bruker Avance-500MHz）;液质联用仪：SYNAPT G2 HDMS超高效液相飞行时间高分辨质谱联用系统（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;Waters 2489半制备液相色谱系统（Waters Corporation， Milford， MA， USA）;SW-CJ-1F超净工作台（苏州广源净化科技有限公司）。

葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Sweden）;ODS-A反相键和硅胶（北京慧德易科技有限责任公司）;高效液相色谱柱YMC-Pack ODS-A，10 ?m，250×10 mm（北京慧德易科技有限责任公司），100～200目柱层析硅胶和GF254薄层硅胶板（青岛海洋化工有限公司）;石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）;色谱甲醇（TEDIA）。

1.2  方法

1.2.1  化学成分的分离  艾纳香叶片（6 kg），阴干，揉碎，用95%甲醇回流提取，合并滤液，减压浓缩至无醇味（400 g），水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取部分减压浓缩至干，得乙酸乙酯浸膏（160 g）。

乙酸乙酯浸膏拌硅胶，上硅胶柱分离，依次用二氯甲烷/甲醇100/0～0/1梯度洗脱，根据薄层色谱检测，合并，获得9个组分，分别编号A～I。I组分用甲醇溶解，上ODS反相键合硅胶色谱柱，用甲醇/水不同比例洗脱共得到3%、5%、10%、20%、30%、40%、50%和100%共8个组分（I1～I8），将30%组分（I5）用甲醇溶解，上Sephadex LH-20柱层析，甲醇为洗脱剂，根据薄层色谱检测进行合并，获得单体化合物1（20 mg），2（51 mg）和3（17 mg）。将10%组分（I3）采用半制备高效液相色谱分离，依次获得3个纯化合物：4（14 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=10.5 min），5（10 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=13.7 min），6（22 mg，50%甲醇，2 mL/min，tR=15 min）。

1.2.2  化合物1～6的抑菌活性测定  80 ℃保存的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus subsp. Aureus），大肠埃希菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株室温解冻后，接种到LB液体培养基上，37 ℃振摇培养过夜，血细胞计数板计数，调整菌悬液浓度为1×108 CFU/mL。将其用MHB培养液（牛肉粉2 g，可溶性淀粉1.5 g，酸水解酪蛋白17.5 g，溶于1 L蒸馏水中，pH 7.4，高压蒸汽灭菌）稀释菌液100倍至106 CFU/mL，作为供试菌悬液。采用微量倍比稀释法[13]测定化合物1～6（图1）对3株供试菌的抑制活性，化合物1～6分别用DMSO溶解，供试样品的浓度范围为128～8 ?g/mL，培养板置37 ℃生化培养箱中培养过夜，观察结果，链霉素为阳性对照，所有实验重复3次，计算最低抑菌浓度（MIC）。

2  结果与分析

2.1  结构鉴定

2.2  抗细菌实验结果

采用96孔板倍比稀释法评价6个单体化合物的抑菌活性，链霉素为阳性对照。活性结果（表1）显示化合物6对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus （DSM 799）具有较强抑制活性，MIC值为64 μg/mL，化合物3对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis （DSM 1088）也具有一定程度抑制活性，MIC值为64 μg/mL。

3  讨论

艾纳香作为海南传统黎药在民间用于清新口气、沐浴以及外敷治疗刀枪伤等外伤伤口，均具有很好的治疗效果，暗示了艾纳香抗菌以防治伤口感染和加速伤口愈合等方面的作用，黎族百姓亲切地称其为“熊猫叶”。现有药理学研究显示，艾纳香提取物具有很好的抑菌活性，如邹婧等[19]报道艾纳香叶提取物对4种口腔细菌具有较强抑制活性。陈艳等[20]研究显示，艾纳香提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和白色念珠菌具有很好的抑制活性，在0.6 mg/mL浓度下，对3株供试菌株的3个月抑制率均达到80%以上。

目前对艾纳香化学成分的研究仍以左旋龙脑、艾油、总黄酮、萜类成分为主，据Pang等[21]2014年统计，已报道的艾纳香非挥发性成分共50余种，几乎全部为黄酮类化合物和倍半萜类成分，其他类型成分报道很少。药用植物发挥一系列药理功效的机制通常是多组分、多靶点的，各类成分之间还可能有协同作用，艾纳香中的功效物质，除了主要的黄酮类和萜类成分外，是否还含有其他结构类型化合物对其药用功效具有协同作用，目前尚不清楚。

Pang等[22]对艾纳香总黄酮促进大鼠皮肤愈合的研究显示，艾纳香总黄酮提取物具有保护伤口避免感染以及加速伤口愈合功效，研究中通过UPLC-Qtof-MS技术对总黄酮提取物的分析发现，除了黄酮类成分外，其中还含有不同种类的绿原酸类成分，绿原酸类化合物具有很好生物活性，尤其是抗菌方面，Zhu等[23]报道洋蓟中的多种绿原酸类化合物对各种细菌和真菌表现出较好的抑制活性，MIC值50～200 μg/mL，因此推测艾纳香中总黄酮为保护伤口和促愈合的主要功效成分，同时提取物中的绿原酸类成分可能对总黄酮的药理功效具有协同作用。本研究从艾纳香中分离并鉴定了多种绿原酸类单体成分，其中1种化合物为首次从自然界中分离获得的新天然产物，6种单体化合物均为首次从该植物中分离，抗菌活性测试显示多种绿原酸类成分对3种供试细菌表现出不同程度抑制活性。

本研究不僅获得一系列抗菌活性先导化合物，而且绿原酸类结构为艾纳香之前的研究中从未发现过的一类活性成分，同时，本研究进一步验证了Pang等[22]对总黄酮提取物的UPLC- Qtof-MS分析结果，有助于解释绿原酸类成分在艾纳香提取物的各种药理功效中的可能发挥的协同作用。

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