山茱萸环烯醚萜苷对APP/PS1/Tau三转基因小鼠脑内病理变化的影响

杨翠翠 包训杰 张 丽 李雅莉 李 林 张 兰

(首都医科大学宣武医院药学部 北京市神经药物工程技术研究中心 北京脑重大疾病研究院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种最常见的痴呆类型和精神障碍。AD的主要临床表现为认知功能减退、精神行为症状和日常社会生活功能减退这3个方面，其主要病理特征为老年斑、神经原纤维缠结、突触和神经元大量丢失。全世界有2亿4 000万人患有AD，且每年新增4 600万新病例，几乎每7 秒钟就有一人患上AD[1]。我国是世界上老年人口基数最大的国家，也是AD患者基数最多的国家[2-3]。据估计，我国已有6～7 百万AD患者，且在65 岁及以上老龄人口中每年以5%～7%的速度在增长[4]。AD致残率高，患者晚期完全丧失独立生活能力，随着我国社会人口的老龄化，AD带来了严重的家庭负担和社会负担。

山茱萸(cornus officinalis)是一种传统补肾中药，新鲜山茱萸果肉中的主要成分有单糖、多糖、有机酸、苷类、环烯醚萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、甾体、三萜、内酯等[5-6]。本课题组[7-8]经过长期研究，从山茱萸果肉中提取的有效成分山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside，CIG)，前期研究表明CIG在体外可以抑制tau蛋白的过度磷酸化，保护细胞骨架结构[7-8]；而在体内试验[9-11]中，CIG灌胃给药能够改善穹窿海马伞切断拟AD模型大鼠学习记忆功能，其主要机制是抗凋亡，保护突触，改善微环境，促进神经再生。

本研究系统探讨CIG对APP/PS1/Tau转基因小鼠的学习记忆影响及其作用机制，主要包括对脑内老年斑沉积、Tau蛋白磷酸化水平以及神经保护作用的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

三转基因小鼠来源于美国Jackson Lab公司，经过笔者科室扩繁，每只均经过基因型鉴定。其中9月龄3×Tg小鼠22只，同月龄野生型对照小鼠11只，雌雄各半；14月龄3×Tg小鼠15只，同月龄野生型对照小鼠15只，雌雄各半；18月龄3×Tg小鼠共计23只，同月龄野生型对照小鼠14只，雌雄各半，均购自中国医学科学院实验动物研究所，动物分级为无特定病原体级(specific pathogen free，SPF)。动物饲养环境是开灯/关灯每天各12 h，恒温(23±1) ℃，食物和水自由摄取。

1.2 药物

CIG(批号：071207)，由首都医科大学宣武医院药物研究室自行研制。山茱萸为市售(产地河南西峡)，经水提、醇沉、大孔吸附树脂层析，提取和分离获得CIG，纯度为70%(其中莫诺苷含量为67%，马钱苷含量为33%)达到国家中药、天然药物5类新药的要求。CIG为棕黄色粉末，水溶性好。实验中采用干粉剂量，溶解于蒸馏水，制成药液应用。

1.3 试剂和仪器

兔抗BDNF抗体(1∶2 000，美国Epitomics公司)；兔抗Tau-Ser404抗体(1∶1 000，美国Invitrogen公司)；兔抗Tau-Thr217抗体(1∶1 000，美国Invitrogen公司)；兔抗Tau-Ser199/202抗体(1∶1 000，美国Invitrogen公司)；兔抗Tau-5抗体(1∶1 000，美国Abcam公司)；小鼠抗β-actin抗体(1∶2 000，美国Santa Cruz公司)；生物素结合的马抗小鼠IgG二抗(1∶200，美国Vector公司)；生物素结合的羊抗兔IgG二抗(1∶200，美国Vector公司)；山羊抗小鼠IgG二抗(1∶2 000，美国Santa Cruz公司)；山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000，美国Santa Cruz公司)；刚果红染色试剂盒(中国迈新试剂公司)；FastSYBR Mixture荧光染料(北京康维世纪生物科技公司)；Genecolour核酸染料(北京金博益生物技术有限公司)；TIANamp Genomic DNA Kit(天根生化科技有限公司)。

Morris水迷宫箱(DMS-2型，中国医学科学院药物研究所)，Fluo Chem化学发光凝胶成像系统(美国Protein Simple公司)；全波长酶标仪(美国Thrmo公司)；冰冻切片机(620-E型，英国Shandon公司)；图像分析系统(Image-pro Plus型，美国)；光学显微镜：(BH-2型，日本Olympus公司)；电泳仪(PowerPac200型，美国BIO-RAD公司)。

1.4 动物分组及给药

16月龄：对照组：野生型(wild type,WT)小鼠8只，WT+CIG低剂量组(100 mg/kg)9只；模型组：3×Tg小鼠7只；药物治疗组：3×Tg+CIG低剂量组(100 mg/kg)7只，3×Tg+CIG高剂量组(200 mg/kg)7只。每日1次灌胃给予等体积CIG或者蒸馏水，从16月龄持续至18月龄。

1.5 免疫印迹法检测

取出脑组织后置于冰上将海马及皮质分离后，放入液氮中速冻，于-80 ℃保存。将冻存于-80 ℃冰箱中的小鼠海马/皮质组织取出并称质量，加入裂解液裂解，之后提取蛋白并定量。蛋白经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至PVDF 膜上，与上述一抗、二抗孵育后，在暗室将超级化学发光底物 A 液与 B 液等量混合，立即加到膜上，0.8 mL/膜，滴匀液体，反应 2 min，然后用滤纸吸去多余荧光剂，将膜放到化学发光凝胶成像仪中曝光 10 s～5 min。将图片存为 TIFF 格式。选择曝光度适中，条带较为清晰的 TIFF 图片采用 TINA 软件进行分析，计算出各组对应条带整合灰度值同 GAPDH 的相对百分比。

1.6 脑组织切片及病理染色

1.6.1 免疫组织化学染色

每只动物取3个脑片放入48孔板中用PBST洗，5 min×3次，吸出PBST，加入400 μL 3% H2O2(体积分数)处理10 min以清除内源性过氧化物酶。PBST洗，5 min×3次；加入用PBST稀释的10% (体积分数)，300～400 μL室温封闭1 h，倾去血清加入用一抗稀释液稀释的一抗，4 ℃孵育24～48 h，PBST洗，5 min×3次；加生物素标记的兔或鼠二抗(稀释度为1∶100)，室温孵育1 h，PBST洗，5 min×3次；加辣根过氧化物酶标记的三抗(稀释度为1∶100)，室温孵育1 h，PBST洗，5 min×3次；DAB显色：将DAB工作液体A、B混合倒入孔板内，将上述处理过的脑片放入染液中显色，注意边染色边在显微镜下观察，避免染色过深，染好的片子用自来水终止显色，贴在载玻片上自然晾干，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6.2 尼氏染色

从48孔板中捞取脑片，平铺于载玻片上充分晾干，将载玻片连同脑片一起置于尼氏染液中染色30 min，之后将取出的脑片用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.6.3 刚果红染色

每只动物3个脑片，平铺于载玻片上充分晾干，低价1滴(100 μL)饱和刚果红液体试剂A，染色10 min；滴加1滴(100 μL)分化液试剂B急速约数秒，镜下控制；用水冲洗5 min；苏木精浅染，水洗，返蓝；常规乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.7 实时荧光定量PCR法(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法检测

取小鼠海马/皮质组织(<20 mg)匀浆，使用QIAamp DNA mini Kit试剂盒抽提总RNA，提取的RNA在Nano Drop 2000进行质量检测。使用Quantscript RT Kit试剂盒将总RNA反转录得到cDNA第一链，具体反应条件如下：10×RT Mix 2 μL；超纯dNTPs 2 μL；随机随物 2 μL；反转录酶1 μL；RNA 4 μL；去RNA酶水9 μL；37 ℃孵育1 h。反转录得到的cDNA第一链用染料法进行荧光定量PCR实验，所用荧光染料为Fast SYBR Mixture，反应体系如下：2×Fast SYBR Mixture 25 μL；正向引物/反向引物各1 μL；cDNA 2 μL；去RNA酶水21 μL。反应条件如下：预变性，95 ℃，20 s；变性，95 ℃，15 s；退火，60 ℃，30 s；延伸，72 ℃，15 s；变性、退火、延伸步骤循环40次；熔解曲线分析：95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；高分辨熔解曲线(high resolution melt，HRM)：70～95 ℃。记录所有样本扩增结果的CT值，并选择CT值最小的样本用Easy Dilution进行梯度稀释，稀释倍数为：3、9、27、81、243、729，每个倍数设置3组平行管，共计18个样本，再进行上述PCR反应，得出结果利用Rotor Gene-Q自带软件计算出标准曲线以及CT值与初始cDNA浓度之间的线性公式，再将之前每个样本CT值带入公式即得出每个样本初始cDNA相对浓度(代表转录水平)。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 CIG对18月龄3×Tg小鼠脑内老年斑的影响

应用刚果红染色方法检测3×Tg小鼠海马CA1区老年斑沉积(Aβ plaques)情况。图1结果显示对照组和对照给予CIG治疗组小鼠海马CA1区没有发现老年斑，3×Tg模型组小鼠海马CA1区可观察到散在的老年斑分布，而给予CIG不同剂量治疗的3×Tg小鼠脑内CA1区老年斑数目明显减少(P<0.01)，详见表1。

GroupDose/(mg·kg-1)NumberofcasesNumberofAβplaques(ofWT)WT-30WT+CIG100100303×Tg-31.00±0.09###3×Tg+CIG10010030.39±0.07∗∗∗3×Tg+CIG20020030.19±0.02∗∗∗

F=55.700，P=0.000;###P<0.001vsWT group;***P<0.001vs3×Tg group.WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside.

图1 CIG对18月龄3×Tg小鼠脑内老年斑的影响Fig.1 Effect of CIG on Aβ plaques in the hippocampus of APP/PS1/Tau mice congo red (Scale bar=100 μm)

WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside; Arrow mean amyloid plaques.

2.2 CIG对18月龄3×Tg小鼠脑内Tau蛋白磷酸化水平的影响

18月龄3×Tg小鼠大脑皮质和海马均观察到Tau蛋白在Thr217位点磷酸化水平与对照组小鼠相比明显升高(P<0.001)，给予CIG低、高剂量可以显著降低3×Tg小鼠脑内Tau蛋白在Thr217位点的磷酸化水平(P<0.01)(图2)。而Tau蛋白在Thr212位点的磷酸化水平和总Tau的表达在模型组、对照组以及CIG治疗组间差异无统计学意义，详见表2、3。

2.3 CIG对18月龄3×Tg小鼠脑内BDNF的影响

18月龄3×Tg小鼠海马脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor， BDNF)表达量相对照组小鼠有所下降，给予CIG低、高剂量治疗后都看到其表达量又有所上升(图3A)。qRT-PCR的结果显示CIG能够增加模型小鼠海马内BDNF mRNA的表达(P<0.001，图3B)。尼氏染色结果显示，3×Tg小鼠海马尼氏小体数量减少，给予CIG 2个月治疗后，尼氏体的数量明显增加,详见表4，图3。

表2 CIG对18月龄3×Tg小鼠皮质内Tau蛋白磷酸化的影响Tab.2 Effect of CIG on Tau hyperphosphorylation in cortex of 3×Tg mice

#P<0.05vsWT group;*P<0.05，**P<0.01vs3×Tg group;WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;CIG:cornel iridoid glycoside.

GroupNumberofcaseHippocampusThr217Thr212WT41.00±0.051.00±0.03WT+CIG10041.19±0.041.05±0.023×Tg41.50±0.04###1.03±0.033×Tg+CIG10041.45±0.031.06±0.053×Tg+CIG20041.25±0.04∗1.04±0.06F55.140.569P0.0000.691

###P<0.001vsWT group，*P<0.05vs3×Tg group.WT： wide type group;WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group;3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg;3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;Thr217：Tau hyperphosphorylation at Thr217 site;Thr212：Tau hyperphosphorylation at Thr212 site;CIG:cornel iridoid glycoside.

3 讨论

AD的典型病理改变为神经纤维缠结和老年斑，并伴随神经元丢失，神经营养因子的减少，这些病理改变均与记忆损伤有关[12-13]。山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc.)为山茱萸科植物山茱萸干燥成熟果肉。补益肝肾，涩精固脱。用于眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱。现代药理学研究[14-15]显示，山茱萸主要具有免疫调节、降血糖、抗氧化及抗癌等作用。CIG是本课题组从山茱萸中提取的有效部位。APP/PS1/Tau小鼠是目前最接近家族型AD的动物模型，具有AD的主要神经病理学特征，出现大脑神经元死亡、突触丢失等AD的重要病理变化，且该转基因动物模型认知障碍出现、病理发生较早，具体病理时程变化见表5，目前已有大量关于抗AD新药研究采用此小鼠作为实验动物模型[16-20]，因此本实验采用3×Tg小鼠作为模型小鼠，野生型小鼠作为对照小鼠，观察CIG对其病理变化的影响，并探索药物可能的作用机制。

WT： wide type group;3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group；WT+CIG100：wide type + CIG(100 mg/kg)group；CIG100：CIG 100 mg/kg；CIG200：CIG 200 mg/kg；Thr217：Tau hyperphosphorylation at Thr217 site；Thr212：Tau hyperphosphorylation at Thr212 site;CIG:cornel iridoid glycoside.

表4 CIG对18月龄3×Tg小鼠脑内神经营养因子mRNA的作用Tab.4 Effect of CIG on BDNF mRNA in 3×Tg mice

图3 CIG对18月龄3×Tg小鼠的神经营养作用Fig.3 Neurotrophic effect of CIG on 3×Tg mice

A: immunohistochemical images of BDNF-stained brain sections in CA1 of hippocampus. Scale bar=100 μm;B: images of Nissl staining for CA3 of hippocampus.Scale bar=100 μm.CIG:cornel iridoid glycoside;WT： wide type group；WT+CIG100：wide type + CIG 100 mg/kg group；3×Tg：APP/PS1/Tau transgenic mice group；3×Tg+CIG100：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 100 mg/kg；3×Tg+CIG200：APP/PS1/Tau mice were intragastricaly administrated with CIG 200 mg/kg;BDNF：brain derived neurotrophic factor.

老年斑是由淀粉样蛋白Aβ沉积引起的[21]。其在特定脑区内聚集，引发相应的神经毒性作用，造成突触损伤，神经元死亡，它是AD多种病理损害产生的发生器[22]。本实验显示CIG能够减少Aβ沉积。目前发现只减少Aβ沉积对Tau蛋白的磷酸化无作用的药物并不能有效减少记忆损伤[23]。因此本实验进一步检测CIG对模型鼠脑内Tau蛋白异常过度磷酸化的影响。研究[24]显示将AD患者脑内纯化出的异常过度磷酸化的Tau蛋白在体外能够进一步明显促进小鼠脑内Thr212及Thr217位点的磷酸化及其聚集。本实验显示18月龄小鼠脑内Tau蛋白在Thr212及Thr217位点的磷酸化水平均明显增加。CIG能够降低其在Thr217位点的磷酸化水平，表明CIG对Tau蛋白的翻译后修饰具有一定去磷酸化的作用。BDNF广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应[25-26]。BDNF的浓度也被作为判断治疗药物对神经功能影响的一个重要指标[27]。正常神经元在生理情况下，尼氏小体数量较多颗粒较大，反映神经细胞合成蛋白质功能较强。当神经元变性严重时，尼氏小体变化尤为明显，可作为神经元损伤标志[28]。CIG能够增加拟痴呆小鼠脑内BDNF的表达，并且能够恢复尼氏小体的含量，保护其形态结构，表明CIG对具有神经营养，减少神经元损伤，提高神经细胞合成蛋白质功能的作用。

表5 APP/PS1/Tau小鼠脑内病理随时程发生的变化Tab.5 Changes in pathology of APP/PS1/Tau mouse brain

Aβ：amyloid β-protein;CA1：CA1 of hippocampal region;PHFs: paired helical filaments;LTP: long-term potention;PPF: paired-pulse facilitation;SP: senile plaques;NFT: neurofibrillary tangles.

Kuznetsov等[23]提出药物只改善A年单一病理变化，并不能有效治疗AD。应该寻找多途径改善AD病理变化的药物。本课题组[29-30]以往研究发现，CIG对穹隆-海马伞切断拟AD大鼠模型、慢性脑缺血拟痴呆动物模型均具有改善学习记忆能力的作用，其主要机制为抑制炎性反应、减少神经元凋亡、增高神经营养因子含量[29]、促进神经发生和血管新生[30]，但并不清楚CG是否能够通过改善AD主要的病理变化提高学习记忆能力。本实验发现CIG能够改善呈现AD主要病理变化的APP/PS1/Tau转基因小鼠学习记忆能力，其机制与CIG减少Aβ沉积，Tau蛋白异常过度磷酸化，增加BDNF表达，保护神经细胞的作用相关。