糖化白蛋白调控肾损伤相关分子与Toll样受体信号通路及齐墩果酸对其干预作用的研究

段 楠 黄辰炜 逄 璐 李海霞

(北京大学第一医院检验科，北京 100034)

糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的微血管合并症之一，也是慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)的最常见病因，最终引起终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)和过早死亡[1-2]。持续高血糖环境所形成的晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)可能造成糖尿病肾脏损伤，糖化白蛋白(glycated albumin，GA)是AGEs前体之一，目前在临床上是反映近2～3周平均血浆葡萄糖浓度的有效指标。本课题组前期研究[3]显示，GA能够上调肾小管损伤相关分子的表达，并促进炎性细胞因子的分泌从而对肾小管造成损伤。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路与炎性反应相关，参与糖尿病等非感染性炎性疾病的发生发展，而GA对其的影响尚不明确。齐墩果酸(oleanolic acid，OA)是一种天然五环三萜类化合物，近年来发现其具有降糖及改善DM的作用[4]，其能否降低GA介导的肾小管损伤也不清楚。本研究拟用GA和OA处理人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞系)，观察肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)肾损伤相关分子水平，并探讨GA和OA对Toll样受体信号通路的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

糖化白蛋白、齐墩果酸(Sigma公司，美国)，人晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)抗体(R&D公司，美国)，DMEM F-12培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清(Gibco公司，美国)，青霉素、链霉素和两性霉素B(Lonza公司，美国)，胰蛋白酶消化液(Gibco公司，美国)，Trizol、cDNA反转录试剂盒、SYBR®GreenPCR荧光染料(Invitrogen公司，美国)，人类KIM-1和NGAL ELISA试剂盒(R&D公司，美国)，兔源性抗p38 MAPK抗体、抗IRAK4抗体、抗TLR1抗体、抗TLR2抗体、抗TLR7抗体及抗TLR9抗体(Cell Signaling Technology公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝科技有限公司，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

实验使用人近端肾小管上皮细胞HK-2细胞系，购自美国标准培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。细胞培养于含有10%(体积分数)胎牛血清，1×10 000 U/L青霉素、10 000 μg/L链霉素及20 μg/L两性霉素B的DMEM-F12培养基中传代培养，培养于37 ℃、5%(体积分数)CO2的饱和湿度空气培养箱。倒置显微镜下观察形态，3 d左右HK-2细胞生长融合成单层细胞，呈典型的铺路石状镶嵌排列。

1.2.2 细胞分组与刺激

取生长良好的HK-2细胞接种于六孔板，待细胞生长至视野70%～80%汇合时，使用无血清DMEM-F12培养基同步化12 h，采用数字表法随机分成对照组与实验组, 刺激浓度参考课题组前期研究[3]与预实验结果：(1)空白对照组：无刺激；(2)人GA组：0.5 mg/mL GA[3]；(3)GA+抗RAGE抗体组：0.5 mg/mL GA[3]，10 μg/mL RAGE抗体(依据R&D试剂说明书，当浓度达10 μg/ mL时，该抗体能够阻断>90%的受体-配体结合)；(4)GA+OA组：0.5 mg/mL GA[3]，80 μmol/mL OA(预实验提示的最小有效浓度)。对以上各组细胞分别进行24 h刺激，每组实验重复3次。

1.2.3 实时荧光定量PCR测定细胞中KIM-1与NGAL mRNA

按照Trizol说明书提取各组细胞总RNA，以2 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书反转录获得cDNA，在ABI 7500仪器(Life Tech公司, 美国)进行荧光实时定量PCR(real-time PCR)。总反应体积20 μL，反应条件：预变性95 ℃10 min，变性95 ℃ 15 s及退火60 ℃ 60 s(共40个循环)。引物设计使用Primer Premier 3.0，由生工(上海)公司合成，稀释为 10 μmol/L工作液，序列见表1。每次3个复孔，每个实验重复3次。目的基因mRNA Ct 值用GAPDH Ct值校正。根据所得Ct值，运用2-ΔΔCT相对定量法计算内参、目的基因的相对表达量。

1.2.4 ELISA法测定培养上清液中KIM-1与NGAL

各组细胞在相应物质处理后，分别收集上清液。按照说明书进行ELISA反应，各步骤结束后30 min内使用酶标仪于450 nm波长处读取每孔吸光度值，根据吸光度值与倍比稀释浓度建立KIM-1和NGAL浓度的标准曲线，样品中KIM-1和NGAL浓度从标准曲线读取。

1.2.5 实时荧光定量PCR测定细胞中Toll样受体信号通路传导的表达

细胞RNA的提取、cDNA的制备以及Real-time PCR的具体操作步骤详见上述的“1.2.3”。Toll样受体信号通路中关键激酶p38 MAPK与IRAK4，以及TLR1、TLR2、TLR7和TLR9的引物设计使用Primer Express 3.0，结果与Pub-Med BLAST比对，引物由生工(上海)公司合成，稀释为10 μmol/L工作液，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blotting法检测细胞中Toll样受体信号通路蛋白的表达

提取各组HK-2蛋白后采用BCA试剂盒对蛋白质定量分析后，取总量相等的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法电泳，转膜后5%(质量分数)脱脂奶粉非特异性封闭1.5 h。加入一抗(1∶500)，4 ℃过夜。以HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶5 000)室温避光孵育1 h，ECL超敏发光液孵育1 min，将膜放入凝胶成像分析系统中显影。用Image J 1.52版软件分析待测蛋白条带灰度与作为内参的GAPDH蛋白条带灰度的比值作为该蛋白的相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 GA与OA对HK-2细胞KIM-1和NGAL mRNA表达的影响

相对于空白对照组，GA组细胞KIM-1和NGAL的mRNA表达均出现显著性上升(P<0.05)，而GA+抗RAGE抗体、GA+OA两组的细胞无显著性变化。并且，GA+抗RAGE抗体组、GA+OA组细胞中KIM-1和NGAL的mRNA表达显著低于GA组(P<0.05)；GA+OA组与GA+抗RAGE抗体组之间差异无统计学意义(图1)。

2.2 GA与OA对HK-2细胞KIM-1和NGAL释放的影响

相较于空白对照组，GA刺激24 h后，HK-2细胞上清液中KIM-1和NGAL的水平均出现显著上升(P<0.05)(图2)。与GA组细胞对比，加入抗RAGE抗体(即GA+抗RAGE抗体组)与OA(即GA+OA组)可使KIM-1及NGAL的释放均有所下降，且加入OA后能显著下调HK-2细胞上清液中NGAL(P<0.05)；GA+OA组与GA+抗RAGE抗体组之间差异无统计学意义(图2)。

图1 各组HK-2细胞KIM-1及NGAL mRNA水平Fig.1 mRNA expression of KIM-1 and NGAL in HK-2 cells

A: mRNA expression of KIM-1 in HK-2 cells；B: mRNA expression of NGAL in HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid..

图2 各组HK-2细胞上清液KIM-1及NGAL蛋白释放 Fig.2 Release of kidney injury molecule-1 in culture supernatants of HK-2cells

A: release of KIM-1 in culture supernatants of HK-2 cells；B: release of NGAL in culture supernatants of HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.3 GA与OA对HK-2细胞Toll样受体信号通路mRNA表达的影响

与空白对照组相比较，GA组具有显著升高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1、TLR7和TLR9 mRNA的表达(P<0.05)，其TLR2 mRNA无显著性变化；并且，相较于单纯GA刺激组，加入抗RAGE抗体以及OA后能显著抑制上述上调作用(P<0.05)(图3)。

图3 各组细胞Toll样受体信号通路mRNA水平Fig.3 mRNA expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.4 GA与OA对HK-2细胞Toll样受体信号通路蛋白表达的影响

各处理组细胞内中未检测到TLR7和TLR9有效值。相较于空白对照组相，GA组具有较高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白表达，以上两组间p38 MAPK与IRAK4差异有统计学意义(图4A，4B)(P<0.05)。在加入OA后，细胞内p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白相对于单纯GA刺激组显著下降(P<0.05)，并与GA+抗RAGE抗体组之间差异无统计学意义(图4C，4D)。

3 讨论

本研究应用GA刺激人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)模拟DKD肾小管损伤的细胞模型，笔者观察到GA能促进HK-2细胞KIM-1和NGAL等肾小管损伤相关分子的表达与释放，并上调TLR1、TLR7、TLR9以及p38 MAPK与IRAK4等炎性反应通路关键激酶的表达，即GA可能通过激活Toll样受体信号通路，在肾损伤过程中起重要作用。在GA刺激情况下分别加入OA和抗RAGE抗体，能够显著减弱GA对肾小管损伤相关分子及以上反应通路关键激酶信号传导的促进作用，提示OA能够干预GA调控的损伤。

DKD的具体发病机制尚未完全明确，许多因素参与其发病[5]。其中，高血糖环境能够通过信号通路的改变、细胞因子的表达以及自由基的产生非酶促诱导形成AGEs，进而高血糖与AGEs共同影响肾小管的功能；RAGE属于受体免疫球蛋白超家族，AGEs能够通过与其的相互作用，触发其二级信使途径(secondary messenger pathways)的激活，参与DKD的发病机制[6]。

图4 各组细胞Toll样受体信号通路蛋白表达Fig.4 Protein expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

A: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of IRAK-4 HK-2 cells；B: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p38 MAPK in HK-2 cells；C: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TRL1 HK-2 cells；D: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TLR2 HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3；IRAK4: interleukin-1 receptor-associated kinase 4;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid;TLR: Toll-like receptor.

糖基化蛋白质GA为AGEs的前体之一，可反映近期(2～3周)平均血浆葡萄糖浓度，在临床上作为监测血糖波动的指标。OA是一种具有抗炎、抗菌、降糖作用的天然抗氧化物，能够降糖并改善DM。本研究模拟体外糖基化刺激肾损伤的细胞模型，将HK-2细胞置于人血清GA、GA+抗RAGE抗体组与GA+OA的环境中，观察各情况下肾小管损伤相关分子和Toll样受体信号通路的表达情况。

目前，OA在许多中药及其制剂中皆作为定量指标，并于疾病模型中被广泛研究，其中包括糖尿病和肾损伤。研究[7]显示，STZ-诱导的糖尿病大鼠经OA处理后肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)有所升高，且肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)的下降存在OA剂量依赖性改善，作为肾功能损害的重要指标尿白蛋白也有所降低；糖尿病小鼠经OA治疗一定时间后，Ccr与血浆胰岛素浓度升高，AGEs相关物质如GA、糖化血红蛋白及Nε-羧甲基赖氨酸等皆出现下降[8]。KIM-1表达于去分化的近端肾小管上皮细胞，在肾损伤时释放到尿液中并且与肾小管间质的炎性反应和纤维化相关，被认为是早期肾损伤的标志物；NGAL是一种小相对分子质量分泌性蛋白，在肾脏受到损伤性刺激时由肾小管上皮细胞分泌至血液、尿液中，是诊断急性肾损伤有效的生物学标志之一[9-10]。本研究显示，GA能显著上调HK-2细胞中肾损伤相关分子KIM-1和NGAL的表达与释放，而经过GA与OA共同处理后，KIM-1及NGAL的mRNA与蛋白水平有所下降，且与抗RAGE抗体封闭AGEs结合位点的实验组差异无统计学意义，提示OA能够干预GA调控的肾小管损伤。研究[11]表明，OA抵抗糖基化反应的作用不仅通过降糖效应而体现，而且还能够直接有效抑制AGEs的形成，本实验中以OA处理经GA刺激的HK-2细胞，其KIM-1及NGAL水平与抗RAGE抗体阻断AGEs受体-配体结合实验组无明显区别，显示OA可能通过降低肾脏糖基化反应引起的损伤，在DM及DKD病程中对肾脏具有保护作用。

近期研究[12-13]显示，免疫与代谢系统结合紧密，Toll样受体信号通路的激活能够启动信号级联反应，导致细胞因子(趋化因子)的产生，从而引发炎性反应，并且参与非感染性炎性疾病(如糖尿病、癌症和肥胖等)的发生发展。本课题组前期研究[3]显示，GA能够促进炎性细胞因子的分泌从而对肾小管造成损伤，此次实验显示，GA可显著上调HK-2细胞TLR1、TLR7和TLR9 mRNA水平，以及p38 MAPK与IRAK4等Toll样受体信号通路关键激酶的mRNA与蛋白表达，提示其能够通过激活此通路而发挥作用。考虑到TLR7和TLR9存在于内溶酶体中[14]，mRNA经转录翻译后蛋白表达量较低，因而通过Western blotting法并未检测到二者有效值。当GA刺激组下分别加入OA，上述表达均显著下降，且与抗RAGE抗体加入后的表达情况差异无统计学意义，表明OA能够干预GA调控的Toll样受体信号传导，在抵抗糖基化反应过程中对肾脏具有保护作用。

综上所述，GA作为AGEs前体能够上调KIM-1和NGAL等肾损伤相关分子的表达与释放，激活Toll样受体信号通路，对人近端肾小管上皮细胞造成损伤；而具有降糖及改善DM作用的OA能够有效干预GA调控的上述损伤。因此，对DM患者进行GA检测，可提示与评估患者肾脏受累情况，预测DKD的发生发展；并且，将OA对糖尿病肾损伤的干预、治疗作用通过进一步的临床研究与验证后应用于临床治疗，能够为DKD的保护靶点与治疗方案提供思路。