多重胶体金免疫层析法检测乳品中β-内酰胺类、四环素类、头孢氨苄抗生素残留

袁晓春

（辽宁省锦州市农业农村综合服务中心，辽宁 锦州 121000）

乳品营养丰富，易消化吸收，且价格相对偏低，是人们日常生活中摄入较多的营养食品。然而在畜禽饲养过程中，为防治奶牛乳腺炎等疾病，常大规模使用β-内酰胺类（青霉素类和头孢类）和四环素类抗生素[1]。不合理使用药物易导致抗生素在乳品中残留，从而危害人体健康。长期服用含有抗生素的乳品，会导致人体过敏反应、中毒反应和细菌耐药性[2]。因此，欧盟、日本、澳大利亚等均设定了牛奶中抗生素类药物的最高残留限量（MRL），我国农业部也设立了相应标准。

目前，牛奶中抗生素残留的检测方法有仪器分析法，微生物检测法和免疫分析法[3-10]。仪器方法如LC-MS/MS具有准确度高、灵敏度高的优势，但因设备昂贵，耗时长且需要专业人员操作等因素而限制了其广泛使用[11]。微生物法如嗜热脂肪芽孢杆菌纸片法前处理简单，耗时短，但需要二次确证[12]。免疫分析法基于抗原-抗体的特异性反应，能达到快速准确定性或定量检测复杂基质中目标物浓度的目的。传统的非均相免疫反应如酶联免疫吸附测定（ELISA），化学发光酶联免疫吸附测定（CLELISA）需要较长的包被孵育时间，繁琐的洗板过程，以及专业的仪器进行信号测定，且一般只能检测单一靶标，具有一定的限制性[13-14]。

胶体金免疫层析法具有空间分辨的优势，可达到同时检测多种药物的目的，且成本低廉，操作简单，能实现快速检测（一般5~10 min），可通过视觉定性或仪器定量。目前，很多研究团队相继报道了利用胶体金免疫层析技术同时检测多种目标物的方法[15-17]。如Han等建立了可同时检测牛奶中β-激动剂，磺胺类药物和四环素类药物的多条带胶体金免疫层析法，可在10 min内通过视觉实现药物半定量检测[18]。

本试验以乳品中广泛残留的β-内酰胺类（青霉素类和头孢类）和四环素类抗生素为靶标，建立多重胶体金免疫层析技术，无需前处理，可在8 min内通过视觉定性检测生乳、纯牛奶和奶粉中20种抗生素残留，为乳品安全的有效监控提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生乳、纯牛奶、奶粉，市售；青霉素G、苄星青霉素、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林、头孢喹肟、头孢乙腈、头孢洛宁、头孢匹林、头孢哌酮、头孢唑林、头孢噻呋、头孢氨苄、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩诺沙星、牛血清白蛋白（BSA），均购自美国Sigma公司；β-内酰胺类抗原、四环素抗原、头孢氨苄抗原、β-内酰胺类受体、四环素类单克隆抗体、头孢氨苄单克隆抗体，均购自北京维德维康生物技术有限公司；氯金酸（三水），购自国药集团化学试剂有限公司；样本垫、吸收垫、PVC背板，购自上海金标生物科技有限公司；硝酸纤维素膜，购自德国Sartorius公司。

1.2 仪器与设备

XYZ3060三维喷点平台，购自美国Bio Dot公司；CM4000裁切机，购自上海金标生物科技有限公司；Milli-Q超纯水系统，购自Millipore公司；Anglent1200型液相色谱-串联质谱系统，购自美国安捷伦公司；高速冷冻离心机，微量移液器，购自德国Eppendorf公司；精密天平，购自德国Sartorious公司；恒温磁力搅拌器，德国Heigoph公司；冷冻干燥机FD-1B-50，购自北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胶体金制备

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[19]。在洁净的烧杯中加入蒸馏水900 mL，添加2%（w·v-1）的HAuCl4（三水）36 mL，加热至沸腾，边搅动边加入1%柠檬酸三钠溶液79.5 mL，当溶液颜色由黄色变成酒红色时继续保持溶液沸腾10 min，然后冷却至室温。

1.3.2 金标探针的制备

将胶体金溶液100 mL装入洁净烧杯中并置于磁力搅拌器上匀速搅拌，添加K2CO3调整溶液pH至8.5，后逐滴加入10 mL用一级水稀释的混合抗体/受体（β-内酰胺类受体，四环素类、头孢氨苄单克隆抗体），搅拌10 min后加入20%（w·v-1）BSA溶液2 mL封闭胶体金上的多余位点，持续搅拌10 min后，在4℃、12 000 r·min-1条件下离心30 min，弃上清，用PBS（5%蔗糖，1%BSA，0.5%吐温20，pH 7.4）0.02 mol将沉淀超声复溶至100 mL，将复溶好的金标探针溶液加入到洁净微孔板中，每孔点样50 μL，放入真空冷冻干燥机中过夜，将冻干的金标微孔用铝箔袋密封好，待用[20]。

1.3.3 多重胶体金免疫层析试纸条组装

β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄三合一试纸条由样本垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC背板4部分组成。将β-内酰胺类抗原（1.1 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），四环素类抗原（0.5 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），头孢氨苄（1.2 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1），羊抗鼠二抗（1.0 mg·mL-1、0.7 μL·cm-1）通过划膜仪包被在NC膜上分别作为三条T线和C线，然后将NC膜置于37℃干燥过夜。样本垫、NC膜、吸收垫依次重叠2 mm固定在粘性PVC背板上，使用裁切机切成4 mm宽的试纸条，放入铝箔袋中干燥保存待用。

1.3.4 乳品中β-内酰胺类、四环素类、头孢氨苄药物检测过程

生乳和纯牛奶样本无需前处理，在检测前充分摇匀即可；奶粉样本每1.0 g加入8 mL一级水溶解、混匀后进行检测。吸取200 μL待测样品于冻干的金标微孔中，小心吹打至紫红色金标探针完全溶解，将金标微孔置于温育器中50℃温育3 min；将试纸条样本垫端插入微孔，静置反应5 min，取出试纸条并去掉样本垫以停止层析反应。根据试纸条T线、C线颜色深浅对比情况判定检测结果：T线显色比C线深或与C线相同，检测结果为阴性；T线显色比C线浅或没有颜色，检测结果为阳性，说明样品中含有目标药物，原理如附图所示，其中T1用于β-内酰胺类的检测，T1用于四环素类的检测，T3用于头孢氨苄的检测。

附图 胶体金免疫层析试纸条原理

1.3.5 检测限

选取经高效液相色谱-串联质谱法确证的不含β-内酰胺类、四环素类和头孢氨苄抗生素的阴性生乳，纯牛奶和奶粉样本，添加系列浓度β-内酰胺类、四环素类和头孢氨苄标准品1~100 μg·L-1，每个浓度系列添加20份样本并平行测定3次，同时检测空白样本做阴性对照，记录检测结果。将T1、T2、T3检测线刚好完全消失的浓度定为检测限（LOD）。

1.3.6 交叉反应

分别向空白生乳、纯牛奶和奶粉中添加青霉素G、苄星青霉素、氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、双氯西林、头孢喹肟、头孢乙腈、头孢洛宁、头孢匹林、头孢哌酮、头孢唑林、头孢噻呋、头孢氨苄、四环素、土霉素、金霉素、多西环素、去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素、卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩诺沙星5、10、20、50、100 μg·L-1，用试纸条平行测定3次，并设置阴性对照，记录检测结果，判断该试纸条的特异性。

1.3.7 假阳性率和假阴性率

随机抽取胶体金试纸条检测阴性生乳、纯牛奶、奶粉样本150份，对出现阳性结果的样本重复检测1次，并经仪器方法复检，统计假阳性数，计算假阳性率。假阳性率计算公式见式1。

随机抽取胶体金试纸条检测β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄阳性添加生乳、纯牛奶、奶粉样品，浓度为对应β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄药物的LOD，共150份。对可疑阴性样本重复检测1次，并经仪器方法复检，统计假阴性数，计算假阴性率。假阴性率计算公式见式2。

1.3.8 实际样本适应性

用胶体金免疫层析试纸条和仪器法分别对50份生乳、纯牛奶、奶粉盲样进行对比测定，平行测定3次，比较测定结果。根据SN/T 2050-2008《进出口动物源食品中14种β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》中所述液相色谱-质谱/质谱法进行操作，方法对生乳、纯牛奶、奶粉中β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄的 LOD 为 0.5~10.0 μg·L-1；根据 GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》所述液相色谱-紫外检测法进行操作，方法对生乳、纯牛奶、奶粉中四环素类药物的LOD为5.0~10.0 μg·L-1。

2 结果与分析

2.1 检测限验证

采用系列浓度添加的生乳，纯牛奶和奶粉进行胶体金免疫层析试纸条的测试，确定试纸条的检测限。样本不含待测药物时，C线和T线均显色；样本中含有待测药物时，随着药物浓度的增加，C线颜色逐渐加深，T线颜色逐渐变浅直到完全消失。试纸条检测限结果见表1。由表1可知，β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素快速检测试纸条在生乳、纯牛奶、奶粉中LOD分别为青霉素G 2.0 μg·L-1、苄星青霉素 2.0 μg·L-1、氨苄西林 4.0 μg·L-1、阿莫西林 4.0 μg·L-1、苯唑西林 6.0 μg·L-1、氯唑西林 6.0 μg·L-1、萘夫西林 20.0 μg·L-1、双氯西林 5.0 μg·L-1、头孢喹肟 8.0 μg·L-1、头孢乙腈 18.0 μg·L-1、头孢洛宁 3.0 μg·L-1、头孢匹林 13.0 μg·L-1、头孢哌酮 6.0 μg·L-1、头孢唑啉 20.0 μg·L-1、头孢噻呋 50.0 μg·L-1和头孢氨苄 45.0 μg·L-1；四环素、土霉素、金霉素、多西环素均为5.0 μg·L-1。

表1 试纸条检测限

2.2 交叉反应

向空白生乳、纯牛奶和奶粉中添加16种β-内酰胺类药物，7种四环素类药物和4种乳品中常检出的残留药物，验证该试纸条的特异性。试纸条交叉反应测试结果见表2。

由表2可知，试纸条对16种β-内酰胺类药物有明显交叉反应（β-内酰胺类受体可识别15种β-内酰胺类药物，头孢氨苄抗体仅可识别头孢氨苄，对其他β-内酰胺类药物无交叉反应），对四环素、土霉素、金霉素、多西环素有交叉反应，对其余3种四环素（去甲基金霉素、甲烯土霉素、二甲胺四环素）和卡那霉素、磺胺二甲基嘧啶、三聚氰胺、恩诺沙星均无交叉反应。

2.3 假阳性率和假阴性率

使用制备的多重胶体金免疫层析试纸条分别检测150份阴性空白样本和150份加标浓度为相应LOD的阳性样本，测试试纸条的假阳性率和假阴性率，以验证方法的可行性，结果见表3。结果表明，试纸条对生乳、纯牛奶和奶粉样品检测假阳性率和假阴性率均为0，重复检测结果未出现错误，符合国家对快检产品检测性能要求，证明试纸条具有较好的重复性。

表2 试纸条交叉反应测试结果

表3 假阳性率和假阴性率

2.4 实际样本验证

用制备的胶体金免疫层析试纸条和仪器法分别对50份生乳、纯牛奶、奶粉盲样进行测定，比较测定结果。仪器方法按照SN/T 2050-2008《进出口动物源食品中14种β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素残留量检测方法液相色谱-质谱/质谱法》中所述液相色谱-质谱/质谱法以及GB/T 22990-2008《牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》所述液相色谱-紫外检测法进行检测，结果见表4。与仪器方法比较，β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素快速检测试纸条检测结果符合率为100%。

表4 实际样本检测

3 结论

本试验成功建立了一种可同时检测生乳、纯牛奶和奶粉中β-内酰胺类-四环素类-头孢氨苄抗生素残留的多重胶体金免疫层析法。乳品样本无需前处理，直接检测，整个检测过程可在8 min内完成，仅通过肉眼可进行定性检测。该方法对乳品中20种β-内酰胺类和四环素类药物的LOD均低于中国MRL要求，且具有快速、简便、成本低、易操作的优势。胶体金作为一种性质优良、合成简便的纳米材料，同时结合免疫层析空间分辨，快速简便等优点，成为快速检测行业中一种强有力的初筛手段，其能够从源头、生产到流通各个环节实现乳品的安全检测，具有重要的经济价值、社会价值和发展潜力。随着快速检测识别、读数技术的迅速发展，胶体金免疫层析的定性检测功能将得到逐步完善，实现半定量、定量检测将成为食品安全快速检测的发展新趋势[21]。