超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中苯并咪唑类药物残留

吴雯娟，黄 婷，钟名琴，丁燕玲，罗 燕*

（1.深圳市农产品质量安全检验检测中心，广东 深圳 518000；2.广东省市场监督管理局食用农产品监管重点实验室，广东 深圳 518000）

苯并咪唑类药物（BMZs）是人工合成的一类多环芳香杂环化合物，因其驱虫谱广、驱虫效果好、毒性低等特点，广泛应用于控制猪、牛、羊的消化道寄生虫病，目前应用较多的BMZs主要有阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑和噻苯咪唑等[1]。过量喂食苯并咪唑类药物或者在哺乳期或者母鸡产蛋期饲用，会导致牛奶、鸡蛋、组织和乳制品等食品中残留该类药物及其代谢产物，而该类药在动物试验中表现出致畸与致突变作用，可以通过食物链，最终危害到人体健康[2]。因此包括中国、美国、欧盟、日本等国家或地区都已经制订了BMZs及其代谢物的最高残留限量（MRL）。《中华人民共和国农业部公告》第235号公告规定苯硫氨酯、芬苯达唑及奥芬达唑在牛、马、猪和羊的肌肉、脂肪、肾中的残留限量为100 μg·kg-1，肝脏中的残留限量为500 μg·kg-1，牛奶与羊奶中的残留限量为100 μg·kg-1[3]。

目前苯并咪唑类药物的检测方法主要有生物学法、免疫学法、高效液相法、气相色谱法（GC）、高效液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等[1,8-9]。BMZs极性较高，难以气化，热稳定性差，直接GC分析灵敏度低，并且需要衍生，操作复杂，因此较少用GC方法测定[4]。文献报道的动物性食品中BMZs提取方法，大多采用液液萃取方法，提取效率低[5-6]。本文从提取和净化方法来探讨动物性食品中BMZs的样品前处理方式，采用振荡和超声波萃取、Watses PRIME HLB固相萃取柱净化技术提取时间短，净化效果好，解决动物性食品中BMZs样品前处理难题，建立了猪肉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留简便、快速、高效的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取新鲜猪肉，充分绞碎，匀质，-20℃避光保存。

1.2 仪器设备

AB Sciex Triple QuadTM 4500质谱仪、NEVAP-24型全自动氮吹仪、多管漩涡混合仪（杭州奥盛仪器有限公司）、梅特勒PL602E型天平、Sigma 3K15冷冻离心机、Milli-Q Integral 3型超纯水仪、奥特赛斯AS系列超声波清洗机、Watses PRIME HLB（6 cc，200 mg）固相萃取柱。

1.3 主要试剂与标准物质

乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯。

乙腈水提取液：乙腈水甲酸（80 20 0.2，V/V/V）。

复溶液：甲醇水甲酸（10 90 0.09，V/V/V）。

标准物质：阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯达唑、苯硫氨酯均为德国Dr.Ehrenstorfer。

1.4 标准溶液的配置

准确称取阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、噻苯达唑、苯硫氨酯的标准品，用甲醇分别配成约1.00 mg·mL-1的标准储备液，-18℃冰箱中保存。

1.5 试验方法

称取试样2.50 g（精确到0.01 g）置于50 mL离心管中，加乙腈水提取液10 mL，漩涡混匀5 min，超声提取5 min，9 000 r·min-1离心 5 min。取上清液3.5 mL直接过Watses PRIME HLB固相萃取柱（6 cc、200 mg），保持1滴/s速度，收集滤液。准确移出2.5 mL滤液至15 mL带刻度离心管内，40℃水浴氮气吹至滤液少于0.5 mL。残留液用复溶液定容至1.00 mL，过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

1.6 仪器条件

1.6.1 高效液相色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），流动相A相为0.1%甲酸水溶液，流动相B相为甲醇，柱温为40℃，进样量5.0 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.6.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：600℃；气帘气压力（CUR）：30 psi；碰撞气压力（CAD）：8 psi；雾化气压力（GS1）：60 psi；辅助加热气压力（GS2）：65 psi。

定性离子对、定量离子对、采集时间、去簇电压及碰撞能量见表2，空白基质及添加药物样本色谱图见附图。

表2 质谱参数

附图 空白样品中添加10.0 μg·kg-1苯并咪唑类药物的色谱

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

精密量取苯并咪唑类药物（噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯）混合标准溶液适量，添加到5个空白猪肉试样中，制得浓度分别为10.0、30.0、60.0、300、600 μg·kg-1的各系列空白添加试样，按1.5试验方法处理试样，供液相色谱串联质谱测定，以峰面积为纵坐标，各化合物的浓度为横坐标建立标准曲线，线性范围、回归方程和相关系数见表3。5种苯并咪唑类药物基质试验的线性为10.0~600 μg·kg-1，峰面积与相应回收浓度呈现良好的线性关系，其相关系数分别为 r=0.993 6、r=0.998 3、r=0.991 2、r=0.992 1、r=0.999 9。

表3 线性范围、回归方程和相关系数

2.2 方法检出限确定

以空白猪肉样本为基质，添加浓度为10.0 μg·kg-1，按照1.5试验方法处理和测定，平行样本n=6，根据各样本检测值计算出平均值X及标准偏差Sb，再根据公式检出限MDL=(k×Sb×C)/X（其中：k为置信因子，一般取3），计算出噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯检出限分别为4.43、6.12、9.97、5.53和3.74 μg·kg-1。

2.3 回收率测定

用空白猪肉试样进行30.0、100和300 μg·kg-13个水平阳性添加回收实验，每个水平取6个平行样，按1.5试验方法处理和测定。噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯平均回收率和相对标准偏差结果见表4。5种苯并咪唑类药物在30.0、100和300 μg·kg-13个水平的阳性添加回收率为86.8%~98.8%，相对标准偏差为3.2%~11.1%。

表4 方法加标回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

本试验建立了动物肌肉中5种苯并咪唑类药物残留的超高效液相色谱－串联质谱测定方法。试验结果表明，方法前处理简单快捷，能有效消除基质干扰，液相色谱串联质谱的条件设置合理，相关参数优化较佳，灵敏度较高，回收率较好，可准确进行定性、定量检测。