人体邻苯二甲酸酯暴露的尿液生物标志物分析方法

黄超囡,李 云,彭俊钰,陈吉平*

(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023;2.中国科学院大学,北京 100049)

邻苯二甲酸酯(phthalates,PAEs)是一类大量生产的化工产品,作为添加剂被广泛应用于服装、涂料、包装材料、医疗器械、儿童玩具、个人护理品、聚氯乙烯地板、墙纸和电子电缆绝缘材料中,其目的主要是为了增加材料的可塑性和柔韧性[1]。PAEs在工业产品中的添加量高达30%～50%,且这些PAEs与高聚物之间不是以共价键形式结合,故在生产、运输、使用以及废弃过程中都会逐渐释放到环境中。邻苯二甲酸二(乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是产量最大的一种PAEs化合物,在欧洲和中国分别占到PAEs总量的三分之一和80%,邻苯二甲酸二正丁酯(di-n-butyl phthalate,DnBP)是全球应用最广的PAEs化合物。

图1 PAEs的分子结构Fig.1 Molecular structure of phthalates(PAEs)

表1 几种常见PAEs的物理化学性质Table1 Physical and chemical properties of some PAEs

Abbr.:abbreviation;* 25 ℃;Sw:water solubility;Kow:octanol-water partition coefficient;Koa:octanol-air partition coefficient;Kaw:air-water partition coefficient;Vp:vapor pressure.

PAEs的结构如图1所示,其中R和R′是两个碳原子数相同或不同的烷基。在常温下PAEs是黏稠液体,难溶于水,易溶于有机溶剂,几种常见PAEs的物理化学性质见表1[2,3]。由于PAEs烷基侧链的碳原子数不同,PAEs具有很宽的蒸气压(Vp)、辛醇-水分配系数(Kow)、辛醇-空气分配系数(Koa)和空气-水分配系数(Kaw)范围。这些物理化学性质决定了不同种类PAEs在环境中的分布情况,短链PAEs如邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、DnBP在水、空气中的浓度比较高,而长链PAEs如DEHP、邻苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate,DnOP)、邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate,DiNP)、邻苯二甲酸二异癸酯(diisodecyl phthalate,DiDP)易于吸附在灰尘、污泥、土壤及水体悬浮颗粒物中[3-5]。故PAEs普遍存在于包括灰尘、大气气溶胶、污泥、污水、河水、海水、饮用水和空气等各类环境介质中[6-8]。

大量研究表明,PAEs是一类内分泌干扰物,会引起生殖能力受损并对后代生殖发育产生影响。PAEs不仅能够通过重新编程改变胎盘和胎儿的表观遗传信息而影响子代,而且能够降低男性生殖激素水平、降低精子质量、造成精子中DNA损伤、减小男婴生殖器与肛门之间的距离以及降低男性特征等[9,10]。此外,PAEs还能导致呼吸系统疾病和神经系统的损害[11,12],而且可能与糖尿病、儿童肥胖症和乳腺癌等多种现代疾病相关[13-15]。新生儿和儿童的饮食方式、手口动作、接触地面和玩具等行为和生活习惯,导致他们暴露于PAEs的量明显高于成人,所以PAEs对新生儿和儿童的健康影响更大[16,17]。

近年来,由于PAEs在环境中的普遍存在及对人体健康的严重危害,对人体暴露水平的评估受到了广泛重视。本文以对人体PAEs暴露水平的评估为切入点,对人体尿液中PAEs生物标志物的选择和分析方法的最新进展进行了回顾和总结,并对其前景进行了展望。

1 PAEs在人体中的代谢

PAEs可以通过饮食、呼吸和皮肤暴露等多种途径进入生物体,在生物体内迅速代谢后,主要随尿液排出体外[18]。PAEs在生物体内的代谢途径主要有两种(见图2)。短链PAEs进入生物体后,其中一个酯键迅速水解,转变为邻苯二甲酸单酯,即初级代谢产物。有研究发现,其初级代谢物邻苯二甲酸单酯的生物活性更强,毒性更大,主要表现为“三致”毒性、胚胎发育毒性和生殖毒性[17,19]。长链PAEs水解为单酯后,还可以通过酶促氧化作用将邻苯二甲酸单酯的烷基侧链转化为更亲水的氧化产物,即次级代谢物[20]。邻苯二甲酸单酯和次级代谢产物均可在尿苷-5′-二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶的催化作用下,生成葡萄糖醛酸结合物,以增加代谢物的亲水性并促进排出。PAEs的代谢途径与其碳链长度密切相关,当侧链上的碳原子数<8时,主要以邻苯二甲酸单酯(M-1)和邻苯二甲酸单酯-葡萄糖醛酸结合物(M-2)的形式排出体外,如DMP、DEP和DnBP等,半衰期为5～6 h。长链PAEs主要以次级代谢物(M-3)以及其与葡萄糖醛酸结合物(M-4)的形式排出,如DEHP、DiNP和DiDP,半衰期大约为12 h[21-23]。

图2 PAEs的暴露及其在人体中的代谢途径Fig.2 Exposure and metabolic pathway of PAEs in the human body

2 PAEs暴露的生物标志物

生物标志物是指示污染物危害效应的生物信号,可衡量环境污染物的暴露与效应。常用的生物标志物包括母体化合物、邻苯二甲酸单酯和次级代谢物[24,25]。相比于PAEs代谢物,母体化合物的测定通常存在3个缺点[26]:(1)PAEs类化合物在环境中普遍存在,采样、前处理及检测等过程极易受到污染,空白值较大;(2)由于酯酶/脂肪酶普遍存在于生物样品中,很难避免PAEs水解的发生;(3)PAEs在生物体中的半衰期很短,被生物体吸收后很快会被代谢,导致其在尿液、血液等生物样品中的浓度较低。所以,对PAEs的暴露评估一般不是测量母体化合物,而是代之以测量它特有的代谢物。

尽管PAEs代谢物在羊水、乳汁、唾液、精液、血液中均可检测到[27,28],但这些生物样品中都存在酯酶,能促进外源性PAEs的水解,从而降低分析结果的准确性和精密度。人体尿液中不含酯酶,且尿液中的代谢物浓度远远高于血液,大约是10～100倍[29]。另外,血液样品的采集范围和采样量有限,且成本较高,而尿液样品具有取样方便、无创伤且采样量足等优点。因此,尿液中的邻苯二甲酸单酯和次级代谢物成为评估PAEs暴露水平的最佳生物标志物。由于血液中代谢物浓度基本不受饮水量的影响,常常用于代谢动力学研究以获得更加合理可靠的数据[30]。

3 样品制备

PAEs代谢物在生物样品中的浓度通常很低,多在ng/mL水平,且生物样品基质复杂,因此用仪器分析之前,需要进行合理的样品采集、保存、富集、净化、浓缩等复杂的前处理过程。众所周知,样品制备是分析过程中的一个关键步骤,也是误差的主要来源,且通常情况下费力多、耗时长、成本高、污染大[31]。PAEs代谢物分析的难点主要表现在以下两个方面:一方面,复杂的生物样品基质对PAEs代谢物的准确定性和定量造成了严重干扰,通常需要加入同位素内标来校正基质干扰[32];另一方面,周围环境和实验试剂、材料等都含有PAEs母体化合物,这些母体化合物可能会因前处理过程不当而引入并发生水解,造成外源性污染,影响代谢物分析的准确性[33]。因此,样品前处理过程的先进与否,直接关系到PAEs生物标志物分析方法的准确性。由于样品前处理过程的重要性,PAEs暴露生物样品制备技术的研究一直是分析化学家关注的焦点。

尿液中PAEs代谢物主要有两种形式:游离态和与葡萄糖醛酸结合的结合态。由于结合态的代谢物一方面很难直接测定,另一方面也很难获得结合态化合物的标准品,因此需要先将结合态的代谢物转变为游离态后再进行测定。美国疾病预防控制中心推荐的方法为:利用大肠杆菌所产生的β-葡萄糖醛酸酶将结合态水解成为游离态,然后测定包括游离态和结合态的PAEs代谢物总量[26]。由于大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸酶具有专一性,即只水解羧基和葡萄糖醛酸结合的酯基,而不水解邻苯二甲酸与醇形成的酯基,从而避免了外源性PAEs水解而引入的干扰。而脂肪酶以及酸、碱等水解方法都不具有专一性,会使外源性PAEs水解从而造成污染,因此不推荐使用。目前通用的预处理条件是在尿液(pH值调至6.5～7.0)中加入一定量的β-葡萄糖醛酸酶,37 ℃下水解,然后加入甲酸、乙酸或氨水等调节溶液的pH以终止酶的水解反应[34]。

直接稀释进样分析法只能用于游离态PAEs代谢物的测定,该方法受尿液基质干扰比较严重,且易造成分离柱堵塞,从而降低分离柱的寿命,通常只能用于PAEs代谢物的快速筛查[35]。为了对复杂样品中的PAEs代谢物进行准确定性和定量分析,必须采用复杂的提取、净化、富集等样品前处理过程,通常包括液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、固相萃取(solid phase extraction,SPE)等。

3.1 液液萃取

液液萃取是利用PAEs代谢物在有机相中的分配系数大于其在水相的分配系数,使其从水相中转移到有机相。为了提高萃取效率,通常需要先调节样品pH值为2左右使PAEs代谢物质子化,或者采用衍生化反应使其疏水性增加,再用甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、己烷、甲苯、二氯甲烷等非极性有机溶剂进行萃取。Kondo等[36]先用β-葡萄糖醛酸酶水解尿液中的结合态代谢物,然后用硫酸调节pH值为2.0并用正己烷提取。用氮气将正己烷吹至近干后加入偶氮甲烷进行衍生化反应,再用弗罗里硅土净化,最后收集洗脱液,浓缩后使用GC-MS分析PAEs代谢物。Yoshida[37]将硫酸酯酶加入到尿液样品中(pH值约为5)水解结合态的代谢物,然后用盐酸调节pH值后用甲苯提取PAEs代谢物。将提取液浓缩后加入N-(叔丁基二甲基硅烷)-N-三氟乙酰胺进行衍生化,最后用GC-MS进行分析。

尽管液液萃取成本较低,但是样品易乳化,净化效果不佳,使用有机溶剂较多,而且,液液萃取后往往还需要对样品进行净化,操作步骤繁琐,费时费力,有逐渐被其他方法取代的趋势。

3.2 固相萃取

由于可供选择的吸附剂多种多样,且具有消耗溶剂少、萃取效率高、净化效果好、操作简单、易于实现自动化、不出现乳化现象等优点,固相萃取越来越广泛地应用于各种样品的提取、净化等前处理过程,已成为一种高效的PAEs代谢物的样品制备技术。

3.2.1离线固相萃取(off-line SPE)

固相萃取吸附剂种类繁多,常见的有亲水-疏水平衡(hydrophilic-lipophilic balance,HLB)吸附剂、反相/阴离子交换混合型吸附剂以及基于硅胶改性的C18吸附剂等。由于C18吸附剂主要依靠反相作用保留目标分析物,导致其对极性较强的PAEs代谢物保留效果较差,回收率偏低,如邻苯二甲酸单甲酯和邻苯二甲酸单乙酯[38]。Chen等[39]采用200 mg C18固相萃取吸附剂萃取200 μL尿液中的5种邻苯二甲酸单酯,采用1.5 mL去离子水淋洗,最后用1 mL乙腈洗脱邻苯二甲酸单酯。结果表明:亲水性较强的邻苯二甲酸单甲酯和邻苯二甲酸单乙酯的回收率较低,分别为69.8%和85.2%,而极性较弱的邻苯二甲酸单丁酯、邻苯二甲酸单苄酯和邻苯二甲酸单乙基己基酯的回收率很好,为94.6%～105.3%。

HLB吸附剂是由亲水单体N-乙烯基吡咯烷酮和亲酯交联剂二乙烯基苯聚合而成的大孔共聚物,具有较高而稳定的回收率,对亲水性差异很大的PAEs代谢物都具有很好的反相保留作用。Feng等[24]用氨水将水解后尿液的pH值调至碱性后加载至HLB(60 mg)小柱,并收集上样溶液的流出液。将流出液的pH值调至2.0后,加载到另一HLB(60 mg)小柱,然后依次用3 mL NaH2PO4和5 mL去离子水淋洗,最后用2 mL乙腈和2 mL乙酸乙酯洗脱,结果表明17种PAEs代谢物的回收率为67%～109%。

反相/阴离子交换混合模式吸附剂同时提供反相和离子交换作用,既能满足极性较强的PAEs代谢物,又兼顾带有长链的非极性较强的PAEs代谢物。此外,由于PAEs代谢物含有羧基,可以通过调节样品pH值使羧基电离而带有负电荷,从而激活PAEs代谢物与反相/阴离子交换混合模式吸附剂之间的静电相互作用,这样就可以使用纯甲醇、乙腈等高强度淋洗液去除尽可能多的仅通过反相作用保留的杂质,获得明显优于HLB和C18吸附剂的净化效果[40]。Zhang等[41]将酶解后的尿液加载至Oasis MAX固相萃取柱后,依次用3 mL去离子水和3 mL乙腈淋洗,最后用3 mL含2%(v/v)甲酸的乙腈/乙酸乙酯(1∶1,v/v)洗脱,加标回收率为84%～122%,且净化效果更佳。

在固相萃取基础上发展起来的固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)既保留了固相萃取的优点,又克服了柱固相萃取样品量大、吸附剂用量大、操作复杂等缺点。SPME集采样、萃取、浓缩、进样于一体,整个过程几乎不需要消耗有机溶剂,大大加快了分析检测的速度。Alzaga等[42]将酶解后尿液的pH值调节至1.5,然后用涂覆有聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯的SPME纤维萃取PAEs代谢物。萃取完成后,将该SPME纤维直接插入重氮甲烷发生器中进行衍生化反应,可以直接用GC-MS分析。另外,磁固相萃取也是一种新型固相萃取方法,具有装置简单,便于固液分离的优点,Rastkari等[43]使用仅1 mg的磁性碳纳米管材料富集净化尿液中的5种PAEs代谢物,回收率高达92.6%～98.8%。

相比于液液萃取,固相萃取减少了有机溶剂的用量,且回收率高,净化效果好。然而,利用离线固相萃取进行PAEs代谢物分析时,通常上样1～3 mL生物样品,这就需要使用较多吸附剂(100～500 mg)和洗脱溶剂(2～5 mL),导致浓缩及溶剂置换过程费时费力,且可能造成目标物损失和干扰,不适用于大批量样品的前处理。

3.2.2在线固相萃取(on-line SPE)

在线固相萃取技术通常使用柱长5～20 mm、内径1～4.6 mm、填料粒径5～30 μm的短柱,采用通道切换便可达到样品制备与分离分析的偶联。该技术集富集、净化、分离和检测于一体,使得生物样品不需要经过复杂的手动处理便可达到分析要求。通常情况下,在线固相萃取要求萃取填料对目标分析物的保留能力比LC分离柱的保留能力稍弱或相当,这样有利于将目标物快速洗脱并在LC分离柱前端富集,从而实现“瞬时浓缩”进样。对于生物样品中PAEs代谢物的分析,常用的在线固相萃取柱填料包括C18、反相聚合物材料、限进材料(restricted access material,RAM)、整体柱材料等[44-46]。限进材料具有独特的结构,不仅填料的外表面键合了二醇基或甲基纤维素等各种亲水性基团,利用分子尺寸排阻的分离原理,将生物样品中的蛋白质等大分子排出色谱柱,而且内表面还键合了各种非极性基团,如苯基、C4、C8、C18等,各种小分子目标物经渗透进入填料内表面后能够通过反相作用被保留[47]。与仅具有疏水保留作用的C18和普通聚合物材料相比,限进材料在净化和富集等方面具有更大的优势,更适用于生物样品的在线前处理过程。Preuss等[48]采用基于反相限进材料Lichrospher RP-8 ADS的在线固相萃取小柱(25 mm×4 mm,25 μm,Merck)与HPLC-MS/MS偶联成功测定了尿液中DEHP的5种主要代谢物。

与填充柱相比,整体柱具有更好的多孔性和渗透性,具有传质速度快、压力低、富集效率高等优点。Kato等[49]将C18硅基整体柱(25 mm×4.6 mm,Chromolith Flash RP-18e,Merck)作为固相萃取介质,建立了人尿中16种PAEs代谢物的在线SPE-HPLC-MS/MS测定方法,且该固相萃取柱反复使用600次后未发现萃取效率降低的现象,使用寿命明显优于填充柱ALexa(25 mm×2.1 mm,30 μm,Varian)。

相对于传统离线固相萃取方法,在线方法的自动化程度高,不需要浓缩溶剂和再溶解等步骤,这不仅有效避免了环境中外源性PAEs的干扰,提高了方法的准确性和精密度,还缩短了样品处理时间,很好地解决了离线固相萃取模式的弊端。而且在线固相萃取吸附剂更容易再生,节约了分析成本。此外,离线固相萃取往往需要较多的样品量(约1～3 mL尿液),而在线固相萃取只需要很少的样品量(约0.1 mL尿液),大大减少了洗脱溶剂的消耗。

4 定量分析方法

4.1 气相色谱-质谱分析方法

在各种分析技术中,GC-MS具有很好的检测灵敏度和相对较低的运行成本,是痕量有机污染物分析的常用技术。由于PAEs代谢物极性强、挥发性低,用GC-MS方法进行定性定量分析之前,为降低其在气相色谱柱上的化学吸附并增加其挥发性,需要对PAEs代谢物进行衍生化处理。常用的衍生化试剂有重氮甲烷[50]、三甲基氯硅烷[43]、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺[37]、N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,BSTFA)[51],且主要通过甲基衍生化、乙基衍生化或硅烷化对羧基进行衍生化处理。由于这些衍生化反应通常需要无水环境,所以PAEs代谢物的GC-MS分析通常与液液萃取、中空纤维液相微萃取等前处理方法相结合,而不太适用于固相萃取、在线固相萃取等有水参与的前处理过程。在PAEs代谢物的GC-MS分析方法中,常用的气相色谱柱有DB-5MS、HP-Ultra 2、HP-5MS SV等,这些色谱柱的固定相主要是5%苯基-95%甲基聚硅氧烷,分析时的温度范围通常为70～310 ℃[25,51]。

表2列出了一些文献报道的GC-MS分析方法,其中电子轰击离子源(electron impact ionization,EI)是最常用的电离源,为了提高检测灵敏度和重现性,避免样品中其他组分的干扰,多采用选择离子监测模式(selected ion monitoring,SIM)。在SIM模式下,质谱检测器只检测选定的特征离子,与全扫描模式相比,在相同的扫描周期内,SIM模式检测每个离子的时间更多,检测灵敏度提高了5～100倍,使得定量限(limit of quantification,LOQ)多达到ng/mL水平以下,这与生物样品中PAEs及其代谢物的浓度基本匹配。Kim等[52]采用6 mL正己烷-乙醚(8∶2,v/v)提取2 mL尿液中的8种PAEs代谢物,浓缩、衍生化后用GC-MS分析,LOQ为0.1～0.5 ng/mL。相比常规GC-MS,气相色谱-高分辨质谱(gas chromatography-high resolution mass spectrometry,GC-HRMS)及气相色谱-串联质谱具有检出限更低、抗干扰能力强和定性更准确等优点,也越来越多地应用于PAEs生物标志物的分析,尤其适用于一些长链PAEs同分异构体代谢物的定量分析[20]。尽管GC-MS具有性能稳定、重复性好、无离子抑制效应等优点,但存在衍生试剂毒性大、衍生化过程繁琐耗时、需无水操作、分析时间长等不足,并不适合在大规模生物监测中使用。

表2 文献报道的人尿中PAEs代谢物的GC-MS分析方法Table2 GC-MS methods that have been described in literature for the analysis of phthalate metabolites in human urine

mPAEs:phthalate metabolites;ED:enzyme degradation;BSTFA:N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide;MCNTs:magnetic carbon nanotubes;LOD:limit of detection;LOQ:limit of quantification;Re:recoveries;MTBSTFA:N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)-trifluoroacetamide;HP-LPME:hollow fiber liquid-phase microextraction.

4.2 液相色谱-串联质谱分析方法

LC-MS/MS结合了液相色谱有效分离热不稳定、难挥发极性化合物的分离能力和质谱仪的高灵敏度优势,成为复杂样品中痕量化合物分离分析的有效手段。目前,LC-MS/MS已经成为生物样品中PAEs代谢物检测的标准方法,可与多种前处理方法联用,如液液萃取、磁固相萃取、手动固相萃取、固相微萃取等,而在线SPE-HPLC-MS/MS实现了集富集、净化、分离、检测于一体,极大地提高了分析速度,是目前最有前景的分析方法。该方法由美国疾病预防控制中心建立,并成功用于美国人体生物监测项目。国内曾建立了全自动固相萃取净化后,LC-MS/MS测定人尿中10种PAEs代谢物的测定方法[34]。但因上述方法的固相萃取装置在国内普及率不高,导致方法推广应用时受到一定限制。

液相色谱柱的固定相材料种类繁多,为分离分析提供了多种选择,但反相色谱柱依然占据绝对优势。PAEs代谢物分析常用的反相色谱柱有C18、苯基、苯基-己基柱等[48,55,56],其中苯基柱不仅提供疏水保留作用,还可以通过π-π作用对含有苯环的PAEs代谢物进行选择性保留,改善分离效果。Kato等[49]在各自的最佳条件下比较了Zorbax SB-CN、YMC ODS-AQ、Betasil Phenyl和Chromolith Performance RP-18e 4种不同类型色谱柱对尿液中16种PAEs代谢物的分离效果,尽管4种色谱柱都可以使邻苯二甲酸单异丁酯与邻苯二甲酸单正丁酯这对同分异构体分离,但只有Betasil Phenyl能确保邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羟基己基)酯和邻苯二甲酸单(2-乙基-5-酮基己基)酯的峰形良好。PAEs代谢物是一系列具有极性差异的羧基化合物,在中性或碱性条件下解离,导致疏水保留强度减弱。因此,在进行液相色谱分离时,需要在流动相中加入适量酸(通常为0.1%(v/v)甲酸或乙酸水溶液)来抑制羧酸电离,这样不仅增强了PAEs代谢物在色谱柱上的保留,而且基本消除了杂质对早期流出的低相对分子质量代谢物的干扰[57]。

大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization,APCI)和电喷雾电离源(electrospray ionization,ESI)是PAEs代谢物质谱分析常用的两种电离源。ESI负离子模式更适合强极性PAEs代谢物的电离,其离子化效率与灵敏度均高于APCI,故应用更为普遍。但基质效应是ESI的一个主要瓶颈问题,因此,在分析之前必须对样品进行适当的净化处理,同时进行基质效应评价,并利用同位素内标法来校正基质效应[44]。而选择性质相似的同位素作为内标,能够提供更准确的定性和定量信息,校正方法误差,从而显著提高方法的准确度和精密度。此外,PAEs代谢物测定一般采用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式来采集信号,同时结合液相色谱保留时间及MRM特征离子对其进行定性和定量。表3列出了一些尿液中PAEs代谢物分析的LC-MS/MS方法。

表3 文献报道的尿液中PAEs代谢物的HPLC-MS/MS分析方法Table3 HPLC-MS/MS methods applied in the literature for the analysis of phthalate metabolites in human urine

* The percentage and ratio are based on volume;AA:acetic acid;FA:formic acid.

近年来,超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)不仅有助于提高分析通量,而且能够在很大程度上减少试剂和样品的消耗,也开始逐步应用于PAEs代谢物的分析。中国疾病预防控制中心建立了一种人尿中9种PAEs代谢物的离线SPE-UPLC-MS/MS测定方法[41]。该方法将2 mL尿液样本酶解2 h后,经Oasis MAX固相萃取柱净化处理,选用Waters ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以0.1%(v/v)乙酸乙腈和0.1%(v/v)乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,在负离子电喷雾及MRM模式下进行测定。该方法操作简便,结果准确,灵敏度高,重现性好,能有效分离多种同分异构体,为今后开展人体生物监测项目奠定了良好的实验基础。相关研究发现,侧链有8个或更多碳原子的PAEs化合物多是由同分异构体组成的复杂混合物(如DiNP、DiDP)。由于复杂的代谢过程,大部分代谢产物至今还没有被识别[61]。目前,利用LC-MS/MS对这类同分异构体化合物进行分离和定量仍然是一个艰巨的挑战。

4.3 质量控制

为了确保数据质量,尿液中PAEs代谢物的分析过程中必须实施严格的质量控制,具体措施主要涉及以下几个方面:(1)全程序空白实验:实验过程中所用的仪器、试剂、环境及人为干扰等都有可能引入外源性污染,为了监测这些因素的综合影响,每批样品分析时都要做空白实验,一般选用模拟尿样作为空白进行相同的提取分析[45];(2)质控标准物质的测定:质控标准物质是专门用于质量控制目的、已知浓度的标本或溶液。每进行一定数目的样品分析后,便插入一个质控样品,将结果与之前比较,唯有变动符合质控要求,方可进行下一个样品的分析。目前,美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)提供有关PAEs代谢物分析的质控标准物质NIST SRMs 3672/3673[62];(3)加标回收率的测定:加标回收率是实验室内经常用以自控的一种质量控制技术。进行PAEs代谢物分析时,通常选取模拟尿样作空白基质,进行一定浓度水平的加标回收实验,也可在实际尿液中添加标准溶液来测定加标回收率;此外还可以通过平行样测定来判断检测精密度状况或是否受控。

5 人体PAEs暴露评估

借助尿液代谢产物的检测方法,国外学者在人群PAEs暴露评估方面开展了大量工作[29,35],国内关于这方面的研究报道不多,必须建立适合我国国情的分析方法,同时进一步筛选、鉴定PAEs暴露的生物标志物,以用于大规模人群的监测。需要注意的是,进行尿液中PAEs代谢物测定时,我们还需要考虑暴露时间与采样时间的间隔。尽管尿液中PAEs代谢物的浓度存在一些日间或月间变异,但研究表明,检测单份随机尿样可代表3～6个月内PAEs的平均暴露水平[63,64]。尿液是测定人群PAEs暴露时使用率最高的样品,但是由于个体生活习惯的不同,导致尿液排泄体积差别很大,这就导致同样暴露量时所获尿液浓度不一致。为了消除不同尿量对代谢物浓度的影响,常用的校正方法有肌酐校正法和比重校正法[17,65]。肌酐代谢量受年龄、性别、饮食习惯、种族等多种因素影响,所以肌酐代谢量的个体差异比较大,尤其是处在生理发育期的儿童。而尿液比重受年龄、性别等差别变异性小,能够更简单方便地对尿液中的代谢产物浓度进行校正[9]。

6 总结与展望

尽管大量研究发现PAEs对人体具有生殖毒性和发育毒性,并且还会增加其他患病风险,但是长期暴露于PAEs对健康的影响尚不完全明了。尿液中PAEs代谢物的测定在采样、前处理及检测过程中均不易受到外源性污染、空白值低,并且具有采样无创伤、采样量足等优势,成为目前人体PAEs暴露评估的最佳手段。邻苯二甲酸单酯和次级代谢物分别是短链和长链PAEs暴露最为常用的生物标志物。相对分子质量越大的PAEs其代谢物越复杂,浓度范围越宽,必须发展先进的检测方法为发现新的生物标志物提供可能,从而能够更好地理解这些化合物对人体健康的影响途径,为毒理学研究提供帮助。在线SPE-HPLC-MS/MS技术因分析速度快、准确度高、灵敏度高等优点,已成功用于发达国家的人体生物监测项目,并将在PAEs代谢物发现、分析中发挥越来越重要的作用。