仿生聚合物材料用于糖肽的高选择性富集

陈 成,康虹健,张小菲,李秀玲*,梁鑫淼

(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023;2.中国科学院大学 北京 100049)

蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰,参与蛋白质折叠、亚细胞定位、更新和传递信息等生命活动[1-3],与病原体感染、肿瘤的发生和转移等生物过程更是密不可分[4-6]。蛋白质糖基化研究不仅有助于发现新生物标志物,开发新药物,还可加深对蛋白质生物功能的理解。

蛋白质的糖基化分析主要依赖MS。虽然MS很强大,但MS分析前必须进行糖肽富集[7,8]。因为即使有超过50%的哺乳动物蛋白质发生了糖基化,但糖肽数量占蛋白质酶解肽段数量的比例却不到5%[9]。且在MS分析中非糖肽还会对糖肽产生一定的离子抑制作用。

目前已发展了多种糖肽富集方法,如硼酸化学法[10,11]、肼化学法[12,13]、凝集素亲和法[14-16]和亲水作用色谱法(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)[17-19]等。每种方法都有其优点和固有的局限性。在这些方法中凝集素亲和法因特异性高和操作便捷等优点应用广泛[20]。每种凝集素识别的糖型不同,如麦胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)富集含有N-乙酰葡糖胺和唾液酸的糖肽/蛋白质[21],刀豆素A(convalina agglutinin,ConA)富集高甘露型糖肽[22],蛋白扁豆凝集素(lens culinaris lectin,LCA)富集岩藻糖糖肽/蛋白质[23]。凝集素亲和法是通过凝集素与特定的单糖、聚糖的糖序列之间非共价键可逆结合来富集糖肽。这种高特异性的蛋白-糖相互作用吸引了很多关注[24-26];凝集素对糖的特异性识别源于两者之间的多氢键作用[27]、CH-π作用[28]和范德华力[29]等。其中糖和凝集素中芳香族氨基酸之间CH-π作用非常重要。在这种作用中,色氨酸参与的比例远高于其他芳香族氨基酸[30]。

氨基酸是蛋白质的基本组成单位。在自然界的20种氨基酸中,研究者已经将天冬氨酸[31]、精氨酸[32]、半胱氨酸[33,34]和组氨酸[35]等分别修饰在硅球上,并用于糖肽的选择性富集。但是还没有用色氨酸作为功能单体的材料。受启示于凝集素对糖蛋白的特异性识别,本文合成以色氨酸为功能单体的聚合物材料,并用于糖肽的选择性富集。色氨酸作为唯一一种带有吲哚基和苯环的氨基酸,与糖不仅会产生多氢键作用,还有产生CH-π作用。希望通过这一仿生材料的设计,为糖肽的富集材料提供新思路和新方向。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UFLC 20A纯化系统(日本岛津公司),HYPERION 3000红外光谱显微及化学成像分析系统(德国布鲁克光谱仪器公司),Zetasizer Nano纳米激光粒度分析仪(英国马尔文公司),JSM-7800F超高分辨热场发射扫描电子显微镜(日本电子),STA 449 F3同步热分析仪(德国耐驰公司),nano ESI Q-TOF MS液相色谱-质谱联用仪(美国Waters公司)。

GELoader吸头小柱购于Eppendorf公司,C18HC固相萃取柱(100 mg/1 mL)和硅胶来自浙江华谱新创科技有限公司,C18膜片购自3M公司,ZIC-HILIC材料购于BioChem公司。

牛胎球蛋白(fetuin,纯度≥99.8%)、牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA,纯度≥98.0%)、尿素(纯度≥99%)、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT,纯度≥99%)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA,纯度≥98.0%)、胰蛋白酶(纯度≥97%)、碳酸氢铵(纯度≥99%)、甲酸(formic acid,FA,纯度≥99%)、乙腈(ACN,色谱纯)均购于Sigma公司。唾液酸糖肽标准品购于购于TCI公司。合成材料所需试剂均购于上海迈瑞尔化学技术有限公司。所有溶液均用Milli-Q去离子水配制。

1.2 实验条件

1.2.1材料合成

Poly-Trp材料采用原子转移自由聚合(atom-transfer radical-polymerization,ATRP)法进行合成。将0.505 g三乙胺(5 mol)加入30 mL含有1.15 g(5 mmol)色氨酸的干氯仿/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,冰浴搅拌10 min,然后逐滴加入0.45 mL(5 mol)质量浓度为95%丙烯酰胺,室温搅拌6 h,后用30 mL蒸馏水洗3次,蒸干溶剂。粗品用岛津UFLC 20A纯化系统进行纯化(C18反相半制备柱),纯化后得到丙烯酰胺-色氨酸(0.88 g,收率62%)备用。

室温下将硅胶4.0 g(平均粒径5.0 um,平均孔径30 nm)悬浮于25 mL 0.1 mol/L盐酸中48 h,使硅胶表面形成足够的硅羟基。得到的硅胶经漏斗抽滤,用水和甲醇依次洗涤3次,真空干燥。

将4.0 mL氨丙基三甲氧基硅烷溶于40 mL无水甲苯后,加入上一步处理过的硅胶,搅拌回流6 h。反应完后放入离心机,以7 000 r/min的速度离心5 min。得到的氨基修饰硅胶依次用无水甲苯和水处理,重复3次分散-沉淀循环,去除未反应的材料,真空干燥。干燥后的氨基硅胶悬浮于30 mL二氯甲烷(含0.8 mL吡啶)中,在0 ℃于30 min内逐滴滴入聚合引发剂溴异喹啉-丁酰基溴化物,然后室温搅拌过夜(避光反应),反应产物以7 000 r/min的速度离心5 min,再用干二氯甲烷分散-沉淀循环6次,真空干燥。

微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定棓丙酯氯化钠注射液中8种金属元素的含量 …………………… 钟振华等（12）：1612

丙烯酰胺-色氨酸用20 mL蒸馏水做溶剂,加入上一步干燥后得到的BIBB-修饰的硅胶,进一步去氧,通过冷冻-解冻-泵循环,然后加入溴化铜和N,N,N′,N′,N″-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)。所得溶液在60 ℃下搅拌6 h,再用7 000 r/min的速度离心8 min,然后依次用水-甲醇分散-沉淀循环洗3次,真空干燥即得Poly-Trp材料。

1.2.2蛋白质标准品酶解和脱盐

每1 mg蛋白质标准品加入100 μL 6×103mol/L尿素,充分溶解后加5 μL 200 mmol/L DTT,于56 ℃振荡孵化45 min。再加入20 μL IAA(200 mmol/L),放置于黑暗常温环境30 min。然后用50 mmol/L碳酸氢铵水溶液稀释10倍,加入25 μg胰蛋白酶,于37 ℃酶解过夜,最后加入5 μL甲酸终止反应。所得的蛋白质酶解液浓度约为1 g/L。上述溶液均溶于50 mmol/L碳酸氢铵水溶液。

C18HC固相萃取柱(脱盐柱)首先用600 μL 50%(体积分数,下同)ACN/0.1%FA水溶液活化,再加入600 μL 0.1%FA水溶液平衡,然后加入3 mL BSA酶解液上样。上样后用1 200 μL 0.1%FA水溶液淋洗,用600 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液洗脱。洗脱液按相应的摩尔比例和fetuin酶解液进行混合。fetuin酶解液脱盐步骤同BSA。

1.2.3乙腈浓度对Poly-Trp材料保留糖肽的影响

称取1 mg Poly-Trp材料,加入乙腈混匀,加压至塞有单层3M C18膜片的Eppendorf枪头,装填成微型SPE小柱。依次用40 μL 50%ACN/0.2%FA和40 μL 85%ACN/0.2%FA水溶液清洗、平衡材料。取10 μg fetuin(溶于30 μL 85%ACN/0.2%FA)上样,分别用80%ACN/0.2%FA、70%ACN/0.2%FA、60%ACN/0.2%FA、50%ACN/0.2%FA各30 μL淋洗,所得馏分进MS分析。

1.2.4酸度对Poly-Trp保留糖肽的影响

1.2.5Poly-Trp材料富集糖肽的选择性

称取1 mg Poly-Trp材料放入微量离心管中,加入100 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液清洗振荡5 min后离心,移除上清后加入100 μL 80%ACN/2%FA振荡平衡。

加入10倍去盐后的BSA:5 μg fetuin和71.6 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去盐至71.6 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸调整溶液含量至80%ACN/2%FA后上样,孵化40 min后均匀加压装填入塞有单层3M C18膜片的GELoader小柱。用20 μL 80%ACN/2%FA淋洗2次,最终用20 μL 60%ACN洗脱。洗脱液进MS分析。

加入100倍去盐后的BSA:5 μg fetuin和716 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去盐至716 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸调整溶液含量至80%ACN/2%FA后上样,孵化40 min后离心去除上清。加入100 μL 80%ACN/2%FA,清洗振荡5 min后去除大部分上清,剩下混匀加压装填入塞有单层3M C18膜片的GELoader小柱。用20 μL 80%ACN/2%FA淋洗3次,最终用20 μL 60%ACN洗脱。洗脱液进MS分析。

1.2.6ZIC-HILIC材料富集糖肽的选择性

同文献方法[36]。

1.2.7氨基硅胶材料富集糖肽的选择性

同1.2.5节方法准备材料及样品,5 μg fetuin和716 μg BSA酶解液一起用C18HC固相萃取小柱去盐至716 μL 50%ACN/0.1%FA水溶液中,加乙腈和甲酸调整溶液含量至85%ACN/1%FA。上样后用20 μL 80%ACN/1%FA淋洗4次,最后用80 μL 10%氨水洗脱。洗脱液用C18小柱去盐至20 μL,进MS分析。

1.2.8Poly-Trp材料吸附量

1 mg fetuin酶解液用C18HC固相萃取小柱去盐至600μL 50%ACN/0.1%FA,加乙腈和甲酸调整溶液体积及含量至4 mL 85%ACN/2%FA。取1.39 mg材料装填SPE小柱,清洗平衡柱,取40 μL(含10 μg fetuin)多次上样,每次的流出液进MS分析。

1.2.9Poly-Trp材料检出限

称取唾液酸糖肽标准品,配置成不同质量浓度的溶液(溶剂为85%ACN/2%FA)。分别取上述溶液1 mL与1 mg Poly-Trp材料孵化上样15 min,然后用20 μL 60%ACN洗脱进MS分析。

2 结果与讨论

2.1 Poly-Trp材料表征

采用ATRP法合成的Poly-Trp材料,其结构示意图如图1所示。所合成的材料通过扫描电镜、红外光谱分析仪、热重分析仪和电势测定仪等进行分析表征。扫描电镜的结果表明,键合后硅球形状没有发生显著改变(见图2a)。从Poly-Trp材料的热重分析曲线图可知,160 ℃以前材料有失重,推测是材料表面物理吸附水所致;而在160～220 ℃间失重可能源于硅球表面的脱水作用;220～420 ℃间失重则应是硅球表面键合的有机聚合物分子链断裂导致(见图2b)。进一步对Poly-Trp材料进行傅里叶红外分析并对主要谱峰进行了归属,图中强吸收峰1 083和460 cm-1分别对应硅球的Si-O-Si和Si-O基峰,相对较弱的峰有1 615和3 406 cm-1,前者源于色氨酸上苯环骨架的伸缩振动,后者可归于色氨酸中吡咯环的仲氨峰(见图2c)。最终测定材料的Zeta电势等电点为3.59(见图2d)。上述结果表明,Poly-Trp材料已经成功制备。

图1 Poly-Trp材料的化学结构Fig.1 Chemical structure of tryptophan functionalizedpolymer materials(Poly-Trp)

图2 Poly-Trp材料表征图Fig.2 Characterizations of Poly-Trp material a.scanning electron microscopic image;b.thermogravimetric (TG)analysis curve;c.infrared spectroscopy spectrum;d.zeta potential curve.

2.2 乙腈浓度对Poly-Trp材料保留糖肽的影响

在考察Poly-Trp材料富集糖肽选择性之前,首先考察了不同乙腈浓度的溶液条件下,fetuin酶解液中糖肽和非糖肽在Poly-Trp材料上的保留情况。由于fetuin酶解液中肽段种类较多,为方便后面的讨论,从fetuin酶解液中选取了3个有代表性的糖肽(分别命名为GP1、GP2、GP3)和2个有代表性的非糖肽(分别命名为NP1、NP2),这些肽段的信息详见表1。图3是0.2%FA条件下85%ACN、80%ACN、70%ACN、60%ACN、50%ACN依次洗脱后,每个肽段信号分布的结果图。肽段信号分布定义为(某一乙腈馏分MS图中目标肽段的强度/各馏分MS图中目标肽段的强度总和)×100%。首先比较非糖肽和糖肽的保留情况,非糖肽NP1和NP2主要集中在85%ACN和80%ACN馏分中,糖肽GP1-3出现在70%ACN及以下馏分,这个结果说明Poly-Trp材料对亲水性糖肽保留强于疏水的非糖肽。Poly-Trp对肽段的保留随着乙腈浓度的降低而变弱,这一现象符合亲水作用色谱的保留特点。其次,对于非糖肽而言,NP1在85%ACN中信号分布为7.7%,在80%ACN中信号分布为80.2%;NP2在85%ACN中信号分布为60.1%,在80%ACN中信号分布为28.5%(见图3)。如表1所示，NP1在Poly-Trp材料上的保留强于NP2,主要是由于NP1的亲水性(亲水系数为-0.35)高于NP2(亲水系数为1.104)。另外,随着乙腈浓度的降低,溶液对非糖肽洗脱强度逐渐增大。对亲水性较强的糖肽而言,糖肽出现在70%ACN馏分至50%ACN馏分区间。具有相同肽链而糖链长度逐渐增加的糖肽GP1、GP2、GP3(见表1)在Poly-Trp材料上的保留依次增强,表现为在60%ACN馏分中的信号分布相应增多:36.2%、41.1%和46.1%(见图3)。这两个现象也符合亲水作用色谱的保留特点,说明亲水在一定程度上参与糖肽的保留。综合以上结果可知,降低乙腈浓度,肽段在Poly-Trp材料上的保留行为基本符合亲水作用色谱保留特点。

表1 fetuin酶解液中选取的代表性肽段信息Table1 Selected specific peptides information in fetuin digest

NP:noglycopeptide;GP:glycopeptide;Hex:hexoses;HexNAc:hexosamines;NueAC:sialic acid.

图3 不同乙腈浓度对肽段在Poly-Trp材料上保留的影响Fig.3 Effects of different ACN concentrations to the peptide retention on the Poly-Trp material

2.3 酸度对Poly-Trp保留糖肽的影响

图4 不同甲酸体积分数对肽段在Poly-Trp材料上保留的影响Fig.4 Effects of different FA(formic acid)volumepercentages to the peptide retention on the Poly-Trp material

在上述不同乙腈浓度对肽段在Poly-Trp材料上保留的研究基础上,改变溶液的酸度,考察了不同酸度条件下材料对肽段保留的影响,结果见图4。在不含FA即中性条件下,3种糖肽和NP2主要分布在85%ACN馏分中,非糖肽NP1主要分布于80%ACN馏分中,整体保留较弱。推测在中性条件下,材料带负电,非糖肽NP1-2和糖肽GP1-3也带负电,强烈的静电排斥作用使它们几乎不在Poly-Trp材料上保留。当加入0.2%FA(pH 2.51)、1%FA(pH 2.15)和2%FA(pH 2)时,随着酸度的增加,非糖肽NP1和NP2分布向85%ACN馏分集中。如2%FA条件下NP1在85%ACN馏分中信号分布为93%,在1%FA条件下NP2在85%ACN馏分中信号分布为90.4%。分析当溶液pH值小于2.51时,材料带正电,非糖肽也带正电,酸度的增加使材料和非糖肽之间的静电排斥越来越强,非糖肽基本不被Poly-Trp材料保留。糖肽在上述FA条件下应带负电或接近电中性,静电吸引逐渐减弱,结果显示3个糖肽在材料上的保留区间虽然没有变化(70%ACN～50%ACN),但是在70%ACN馏分中信号分布有不同程度的增加。综上,中性条件下,Poly-Trp材料与fetuin糖肽之间的静电排斥作用利于洗脱,与非糖肽之间的静电排斥作用使非糖肽和糖肽保留交叉,不利于富集;提高甲酸浓度,借助材料与非糖肽之间的静电排斥作用,通过在高乙腈相条件下淋洗去除大部分的非糖肽,可提高Poly-Trp材料富集糖肽的选择性。

2.4 Poly-Trp材料选择性富集糖肽

在上述研究的基础上,使用feutin酶解液为样品优化了Poly-Trp材料富集糖肽的条件:上样条件为85%ACN/2%FA,淋洗条件为80%ACN/2%FA,洗脱条件为60%ACN。采用这样的富集条件,fetuin酶解液经Poly-Trp材料富集后得到29条糖肽,有效去除了非糖肽(见图5a)。而自然界中的生物样品往往更为复杂,为考察Poly-Trp材料富集糖肽的选择性,将含量相对较高的BSA作为干扰物加入fetuin酶解液中再进行富集。当掺入物质的量倍数为10的BSA时,Poly-Trp材料一共富集到25条糖肽(见图5d),高于作为对照、没有键合上丙烯酰胺化色氨酸官能团的氨基硅胶材料富集到的9条糖肽(见图5b)。说明Poly-Trp材料富集糖肽具有一定的抗干扰能力,同时证明材料的富集选择性来自于键合上的丙烯酰胺化色氨酸官能团。进一步掺入物质的量倍数为100的BSA时,Poly-Trp材料仍能富集到20条糖肽(见图5e)。对比商品化ZIC-HILIC材料,重复3次富集掺入物质的量倍数为50的BSA(图见5c)时只能看见fetuin糖肽中相对丰度较高的1 634.3 495(4+)。Poly-Trp材料相对ZIC-HILIC材料,在较为复杂的样品中显现了较好的选择性。同时测得Poly-Trp材料对糖肽的吸附量为21.6 mg/g(fetuin酶解液),且具有较好的检出限(3.44 μmol/L,唾液酸糖肽标准品,信噪比大于3)。上述结果表明,Poly-Trp材料可实现糖肽的高效富集。

图5 Poly-Trp材料和两种对照材料富集糖肽MS谱图Fig.5 Mass spectra of glycopeptides enriched with Poly-Trp and two control materials a.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin with Poly-Trp material;b.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA (bovine albumin)at amount of substance ratio of 1∶10 with aminated silica;c.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶50 with ZIC-HILIC material;d.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶10 with Poly-Trp material;e.mass spectrum of glycopeptides enriched from digests of fetuin and BSA at amount of substance ratio of 1∶100 with Poly-Trp material.Glycopeptides are marked with lines.

3 结论

在本研究中合成了一种新型仿生聚合物材料Poly-Trp,并对其结构进行了表征。通过考察不同乙腈浓度、酸度等溶液条件对肽段在材料上保留的影响,优化了糖肽的富集条件。在此基础上,通过加入BSA作为干扰物,与两种对照材料富集结果依次进行对比,验证了Poly-Trp材料选择性来自于键合上的色氨酸官能团,且Poly-Trp材料对糖肽的富集选择性优于商品化ZIC-HILIC材料。Poly-Trp材料对糖肽的高富集选择性证明了仿生聚合物材料设计的可行性,该类材料在糖肽的选择性富集领域具有潜力,对其进行深入的研究及进一步开发将为糖肽富集新材料的研发提供新的思路。