结构蛋白质组学研究进展

周 烨,刘哲益,王方军*

(1.中国科学院大连化学物理研究所,中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023;2.中国科学院大学,北京 100049)

蛋白质是生命体遗传信息的翻译产物和生物学功能的主要承担者,催化和控制生物体内几乎所有过程。蛋白质组学(proteomics)是对生命体内的全套蛋白质进行规模化系统分析的新兴学科,其研究范围不仅包括蛋白质的规模化定性和定量,还包括蛋白质的翻译后修饰、相互作用、结构和功能研究。蛋白质生物学功能的实现与其空间结构密切相关,蛋白质功能的调控也主要依赖于其构象和相互作用的动态调节;对蛋白质结构和功能的研究一直是生命科学领域的研究热点,也是当前蛋白质组学研究的重要发展方向[1,2]。

自从20世纪50年代后期第一个蛋白质结构被解析以来[3],全世界已经有46 000多个蛋白质和蛋白质复合物的结构被成功解析,极大促进了蛋白质生物学功能的阐释和后续靶向调节试剂的设计开发。解析蛋白质结构的常规方法包括X射线晶体衍射(X-ray crystallography,XRD)技术[4]、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技术[5]和冷冻电镜(cryo-electron microscope,cryo-EM)技术[6]。XRD只能提供蛋白质的静态结构信息;NMR虽然能够监测蛋白质在溶液中的构象变化,但是通常只能用于30 kDa以下的蛋白质;近年来,cryo-EM发展迅速,已经成为结构生物学分析的主流方法,但是仪器设备价格较为昂贵。此外,以上3种方法对蛋白质样品的纯度和用量要求较高,样品制备难度较大。

20世纪80年代,Tanaka[7]和Fenn[8]分别发展了基质辅助激光解吸离子化(matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI)和电喷雾离子化(electrospray ionization,ESI)新方法,拓展了质谱(mass spectrometry,MS)在分析肽段和蛋白质等热不稳定、难挥发的大分子中的应用,引发了质谱分析蛋白质的革命,蛋白质组学研究进入了以质谱为核心分析平台的新阶段。质谱具有高精度、高灵敏度、高通量的特点,能够实现对复杂蛋白质组样品的规模化分析鉴定。目前,蛋白质组学分析方法已经被越来越多地应用于蛋白质相互作用和结构分析,其特点是不受蛋白质尺寸和纯度的限制,可以进行高通量动态分析。常用的结构蛋白质组学分析方法包括基于整体活性蛋白质分析的非变性质谱分析方法和基于酶解肽段分析的限制性蛋白质酶切法、化学交联法、氢氘交换法、共价化学标记法等方法。随着这些新方法的不断进步,结构蛋白质组学在近年来取得了快速发展,在蛋白质组成和构象动态变化分析、小分子药物-蛋白质识别机制研究等方面有着越来越广泛的应用。

本综述将简要概述蛋白质结构分析的经典方法,并重点讨论近年来结构蛋白质组学新方法的发展和应用情况,最后对结构蛋白质组学的未来发展进行总结与展望。

1 蛋白质结构分析常规方法

1958年,历史上第一个蛋白质结构诞生,Kendrew等[3]通过X射线晶体衍射法测定了肌红蛋白质的晶体结构,X射线晶体衍射技术随之成为确定原子水平蛋白质结构的经典方法。当X射线照射蛋白质时,射线被蛋白质分子中的电子散射,记录为衍射图案从而获得电子密度图,从中可分析获得原子位置和化学键的信息,得到蛋白质结构。由于X射线对单个蛋白质分子的衍射能力非常弱,因此需要通过蛋白质晶体来实现探测信号的扩增,这也限制了X射线晶体衍射技术的高通量应用。蛋白质结晶通常非常耗时,需要测试多达数百个结晶条件,而且对蛋白质样品的纯度要求非常高。整合膜蛋白质、大分子复合物、无序蛋白质和多结构域蛋白质等很难得到结晶。此外,该方法仅得到蛋白质单一构象的静态结构信息,与溶液中蛋白质的活性动态构象可能有不一致的情况。

1985年,Wüthrich等[9]首次将核磁共振技术应用于蛋白质结构测定,得到了公牛精浆的蛋白酶抑制剂IIA的结构。在NMR实验中,需要将溶液中的蛋白质置于强磁场中,通过发送特定频率的电磁波,使蛋白质中原子核与电磁波发生共振。核磁共振时,由于蛋白质原子所处的化学环境不同,原子核吸收的电磁波能量也不同,产生不同的共振谱信号。通过不同原子的化学位移(1H或13C),可以重建原子之间的化学联系,从而得到蛋白质的结构信息[10]。与X射线晶体衍射相比,NMR的主要特点是分析在溶液状态的活性蛋白质结构,可以监测不同蛋白质构象间的动态变化,是理解与蛋白质功能密切相关的构象动力学的有效手段[11]。然而,NMR需要进行蛋白质同位素标记(如15N、13C),样品纯度和用量要求较高(mmol/L级)[12],而且对于相对分子质量较大的蛋白质和蛋白质复合物研究困难[13]。

近年来,随着冷冻电镜技术的快速进步,能够直接对液体、半液体的生物分子进行高分辨率结构测定。具体方法是,将蛋白质样品快速冷冻,使其玻璃态化,然后通过冷冻传输系统放入显微镜观察,通过计算机提取和重构软件等处理得到图像,生成准确、详细的亚细胞和分子级复杂蛋白质结构3D模型[14]。2013年,程亦凡等[15,16]利用冷冻电镜技术首次获得了300 kD膜蛋白TRPV1的0.34 nm分辨率的三维结构,并建立了该分子的原子模型。自此,冷冻电镜在结构生物学领域蓬勃发展。冷冻电镜的研究对象十分广泛,从细胞、细胞器到超大蛋白质复合物,均能够进行结构解析。例如核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)是生物体内最复杂的蛋白质复合体之一,它由30多种不同的蛋白质亚基构成,Eibauer等[17]利用冷冻电镜技术成功解析了该复合体的精细结构,并提出了核孔控制大分子物质出入的新模型。虽然冷冻电镜技术的发展极大加速了蛋白质的结构解析速率,但还存在价格昂贵、维护成本高、对样品的纯度和用量要求较高、表征通量低的不足。

2 非变性蛋白质质谱分析方法

近年来一系列基于质谱的结构蛋白质组学分析方法得到快速发展,表1简要总结了各种分析方法的优点和局限。其中针对非变性整体蛋白质的质谱分析方法能够对蛋白质和蛋白质复合物进行直接表征,其分析目标包括10～20 kDa的小相对分子质量完整组蛋白,150 kDa的大相对分子质量抗体,以及500～20 000 kDa的细胞机器(如蛋白酶体、核糖体、甚至是完整的病毒组装体[18,19])。

表1 不同结构蛋白质组学分析方法的优缺点Table1 Advantages and limitations of the main structural proteomics methods

2.1 非变性质谱法

随着高分辨、高质量检测范围质谱技术的发展,非变性质谱法(native MS)能够对活性状态下的完整蛋白质、非共价蛋白质-蛋白质相互作用复合物和蛋白质-受体复合物进行直接研究[20]。非变性质谱需要使用与ESI-MS兼容的挥发性缓冲液,例如乙酸铵缓冲液,浓度范围为5 mmol/L至1 mol/L、中性pH,在此分析条件下通常可以保持蛋白质的活性结构[21]。通过高分辨质谱对蛋白质复合物精确相对分子质量进行测定,可以直接确认复合物的组成形式、亚基之间的化学计量关系、解离常数等。非变性质谱法还可用于检测蛋白质的变体、翻译后修饰(PTMs)以及电荷分布情况。Loo等[22]利用非变性质谱表征嗜热链球菌和兔的20S蛋白酶体(20S proteasome),证实了192 kDa的α7环结构和完整的690 kDa的α7β7β7α7的化学计量关系,发现哺乳动物蛋白酶体具有比细菌蛋白酶体更高的异质性。Heck等[23]使用高分辨率、高精度质谱分析激酶Plk1及其共激活因子Aurora激酶A(Aur-A)和Bora的多位点磷酸化调节蛋白质系统,发现Aur-A/Bora介导的Plk1激活伴随着Aur-A/Bora和Plk1/Bora异二聚体的形成;同时Aur-A/Bora的相互作用独立于Bora的磷酸化过程,而Plk1/Bora的相互作用依赖于Bora的多位点磷酸化。近年来,非变性质谱越来越多地用于研究蛋白质非共价相互作用,在研究蛋白质结构功能和组装动力学方面表现出显著优势。

2.2 离子迁移质谱

离子迁移质谱(ion mobility MS)是在质谱检测器前端添加离子迁移管,通过检测活性蛋白质在气相迁移过程中气体碰撞截面的差异监测蛋白质结构的差异和构象变化[24,25],包括检测相同蛋白质的不同构象异构体[26]和蛋白质的不同寡聚状态[27]。具有相同质荷比的蛋白质在不同构象或聚集状态下,由于电荷数和体积大小不同,碰撞截面不同,从而具有不同的离子迁移率[28]。因此,IMS检测到的离子迁移率的变化能够解释结构变化信息,例如Marcoux等[29]利用IMS检测配体诱导的ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白P糖蛋白的构象变化;Uetrecht等[30]通过IMS表征诺如病毒的组装过程。

针对活性整体蛋白质的非变性质谱法目前主要分析对象还是相对分子质量较小(<150 kDa)的水溶性蛋白质,对于相对分子质量较大、疏水性较强的蛋白质如膜蛋白质及其复合物的分析仍然非常困难,需要对缓冲体系组成(表面活性剂和缓冲盐的种类、浓度等)、仪器检测参数等进行深入优化。

3 基于酶切肽段的结构蛋白质组学分析方法

以酶切肽段为分析对象的“自下而上”蛋白质组学分析方法在鉴定蛋白质序列和修饰方面具有巨大的优势,不仅是蛋白质组学的标准工作流程,还可以通过结合溶液内的化学或酶促修饰手段在肽段水平上探测蛋白质分子结构和相互作用。其中,最常用的方法包括限制性蛋白质酶切、化学交联、氢氘交换、共价化学标记和热稳定性法等。这些方法具有分析灵敏度高、通量高、不受蛋白质相对分子质量限制、样品用量少和纯度要求低等特点,已经引领了结构蛋白质组学分析的发展方向并且成为传统蛋白质结构分析方法的重要补充。

图1 限制性蛋白质酶切-质谱实验流程图[32]Fig.1 Workflow of a LiP-MS experiment[32]Rel:Relative;int:intensity;RT:retention time.

3.1 限制性蛋白质酶切

蛋白质酶解在生物化学过程中具有重要作用,例如消化、分解代谢、蛋白质成熟/活化、信号传导等[31]。蛋白质酶解的过程需要底物蛋白质适应蛋白酶活性位点的诱导机制形成水解反应的过渡态。当活性蛋白质区域结构不能被蛋白酶识别,例如与小分子相互作用或发生了构象变化时,则该蛋白质区域不能被蛋白酶完全水解,即产生限制性蛋白质酶切(limited proteolysis,LiP)[32],其实验流程如图1所示。因此,通过研究限制性酶切发生区域和效率差异可得到蛋白质相关区域的结构和相互作用信息。LiP实验主要包括在溶液条件下使用非特异性蛋白酶,如嗜热菌蛋白酶(thermolysin)或蛋白酶K(proteinase K),处理活性状态下的蛋白质样品,并使用蛋白质组学定量分析方法测定酶切肽段含量变化[32],例如谱图计数(spectra count)[33]、选择反应监测扫描(selective reaction monitoring,SRM)[33]、细胞培养稳定同位素标记(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)[34]等定量方法。Picotti等[33,35]使用限制性酶切策略对大肠杆菌细胞内蛋白质不同生理状态下结构变化及其与小分子相互作用情况进行高通量分析。当小分子结合活性蛋白质时阻碍了蛋白酶K水解相互作用的区域,降低了该区域蛋白酶解效率。随后将蛋白质变性并用胰蛋白酶充分酶解,通过定量蛋白质组学分析推断蛋白质与小分子的相互作用区域。通过此方法,Picotti等[35]发现了柠檬酸盐和激酶Ppc间的相互作用,并通过体外酶活性测试实验证实柠檬酸盐对Ppc的抑制作用;同时发现了磷酸烯醇丙酮酸盐、柠檬酸盐和鸟苷三磷酸与激酶PfkB存在相互作用,并将其应用于鉴定新的酶-底物关系。限制性蛋白质酶切策略可以应用在规模化分析蛋白质结构改变、鉴定结构变化的特定区域、蛋白质聚集分析、目标蛋白质的靶向分析等方面,但是该方法对酶解条件的控制要求较为严格,结构分辨率不高,并且对膜蛋白质和复杂样品中的低丰度蛋白质的结构检测仍存在较大困难。

3.2 化学交联法

化学交联法(chemical cross-linking MS,CXMS)能够用于分析蛋白质构象、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-核酸相互作用,是近年来迅速发展的结构蛋白质组学新兴方法[36]。化学交联质谱实验流程如图2所示,使用特定长度的化学交联剂共价连接单个蛋白质之内或不同蛋白质之间的功能基团,再对交联蛋白质样品进行酶切和蛋白质组学分析,并利用专业的交联数据处理软件鉴定交联位点。最常用的交联试剂可与氨基酸侧链的氨基或蛋白质N端的氨基发生交联反应,主要有二(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯(bissulfosuccinimidyl suberate,BS3)、辛二酸二琥珀酰亚胺(disuccinimidyl suberate,DSS)、二(磺基琥珀酸亚酰胺)戊二酸酯(bissulfosuccinimidyl glutarate,BS2G)和双琥珀酰亚胺戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate,DSG)。由于交联试剂两个反应基团之间的臂长限制,只有在空间距离上足够近的两个氨基酸才有可能被共价连接起来。通过质谱分析鉴定这些交联位点,能够初步确定交联蛋白质位点间的空间距离,从而提供一种低精度的结构信息[37]。Erzberger等[38]通过化学交联策略建立了翻译起始复合体40S·EIF1·eIF3的结构模型,并确定了真核起始因子EIF3a的C端结构域在核糖体40S上的位置。北京生命科学研究所董梦秋团队与中科院计算所贺思敏团队[39]于2012年合作开发了化学交联质谱数据处理软件pLink,并应用于大肠杆菌蛋白质组样品交联结果的分析,目前该软件可以进行蛋白质复合物和复杂样品大规模交联数据的解析。

图2 化学交联质谱实验流程图[40]Fig.2 Workflow of a chemical cross-linking MS (CXMS)experiment[40]

近年来,化学交联结构蛋白质组学方法不断发展和改进。酶解后的肽段在进入质谱分析之前,往往会采用富集或分离的手段(如体积排阻色谱[41]、离子交换色谱[42]、亲和标签富集[43,44]等)降低样品的复杂程度以提高后续质谱分析和数据处理的准确性和通量。体内化学交联也越来越多地应用于研究活性细胞环境中的蛋白质相互作用[45,46]。新型交联剂的使用,如光反应性交联剂SDAD(succinimidyl 2-((4,4′-azipentanamido)ethyl)-1,3′-dithiopropionate)[47]和可碎裂交联剂DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea)[48],显著提高了交联肽段的质谱鉴定效率和可信度,使得该技术得到了更广泛的应用。

3.3 氢氘交换法

图3 氢氘交换质谱法实验的基本步骤[52]Fig.3 General steps of the hydrogen-deuterium exchange(HDX)-MS experiment[52]ESIMS:electrospray ionization mass spectrometry;ETD:electron transfer dissociation.

氢氘交换法(hydrogen-deuterium exchange,HDX)作为探测蛋白质结构的手段在20世纪70年代初引入,是最广泛使用的方法之一[49]。氢氘交换法将活性蛋白质骨架酰氨基的活泼氢原子置换为氘代溶剂(D2O、CH3OD等)中的氘原子,并通过蛋白质组学方法检测酶解肽段质量偏移确定发生氢氘交换蛋白质区域[50]。一般暴露在外侧、与溶剂密切接触的蛋白质骨架酰氨基氢原子容易发生氢氘交换,比位于蛋白质内部或参与氢键形成的氢原子交换速率更快。氢氘交换的速率可以揭示溶剂中氘原子进入蛋白质特定区域能力的强弱,根据交换速率的不同和变化可以监测蛋白质的结构及动态变化[51]。此外,氢氘交换法还能够提供蛋白质相互作用位点以及翻译后修饰引起的构象变化信息。氢氘交换法基本步骤如图3所示,将蛋白质样品从H2O转移到基于D2O的缓冲液中,实现氘代标记;然后在不同时间点酸化和冷却溶剂以淬灭该交换反应;最后对反应混合物进行蛋白质组学分析,获得不同肽段区域发生氢氘交换的程度异同,揭示蛋白质的溶剂可接触区域及结构变化情况。

目前氢氘交换法越来越多地应用在膜蛋白质的结构生物学研究方面,揭示膜受体的相互作用[53,54]、膜蛋白质的构象动态变化[55]或蛋白质-膜相互作用[56]。此外,氢氘交换法是研究伴侣蛋白与底物相互作用的一种有效方法。区分特异和非特异性的伴侣蛋白-底物相互作用和底物内相互作用难度较大,并且相关相互作用在底物折叠过程中动态变化,进一步增加了相关研究的难度。D’Arcy等[57]利用氢氘交换法表征了组蛋白H2A-H2B异二聚体与其伴侣蛋白Nap1之间的相互作用,证实了Nap1可以限制H2A-H2B的构象多变性,将其部分无序的组蛋白折叠结构域转变为更有序折叠的构象。同时他们绘制了Nap1/H2A-H2B的结合界面,揭示了Nap1和H2A-H2B内的协同解折叠现象。氢氘交换法是研究蛋白质结构和相互作用动力学的有效工具,其缺点主要是在样品酶解、色谱分离、质谱离子化等过程中存在氢氘回交现象,需要对样品预处理和色谱分离等条件严格控制,如保持温度和低pH等,降低了色谱分离分辨率和质谱分析性能[50]。

3.4 共价化学标记

共价化学标记(covalent labeling)与HDX类似,利用蛋白质上活性基团的反应性差异来揭示结构信息。HDX主要通过探测酰胺骨架位点的反应性来监测二级结构水平的动力学蛋白质结构,而共价化学标记技术通过对氨基酸侧链活性基团进行修饰(如氧化、乙酰化、琥珀酰化等)提供反应性的相关信息。溶剂暴露区域的氨基酸容易与共价标记试剂反应,而由于蛋白质相互作用或构象变化导致埋藏在蛋白质内部的氨基酸被“保护”起来,难以进行标记反应[58]。基于这种反应性的差异,利用蛋白质组学高通量分析蛋白质标记发生区域及其标记程度,即可得到相关结构信息。

羟基自由基足迹法(hydroxyl-radical footprinting,HRF)是一种广泛使用的蛋白质结构分析共价标记方法,该方法利用羟基自由基氧化修饰蛋白质中溶剂可接触的氨基酸位点。有17种氨基酸的侧链可被羟基自由基氧化,其中巯基侧链最容易发生反应,其次是芳香族和脂肪族侧链[1]。羟基自由基可以通过多种物理或化学方法产生,包括高能同步辐射[59]、γ射线辐射[60]、脉冲电子束[61]和电化学流动池[62]等。此外,还可以通过紫外激光光解过氧化氢产生羟基自由基,这种技术通常被称为蛋白质的快速光化学氧化(fast photochemical oxidation of proteins,FPOP)[63]。Vahidi等[64]利用FPOP考察了不同时间点的肌红蛋白在折叠期间的氧化修饰,揭示了不同时间点不同蛋白质区域的氧化程度,结果表明肌红蛋白的折叠由疏水侧链的相互作用引起,如图4所示。由于溶剂可接触性是HRF法的主要决定因素,因此当配体结合或不同生物状态诱导的结构变化引起溶剂可接触性改变时,可利用HRF鉴定相互作用位点和构象变化的区域[65]。该方法也可以应用于蛋白质-DNA复合物[60],内在膜蛋白(integral membrane proteins,IMP)结合研究[66],并可用于细胞内实验[67]。然而,HRF的氧化特异性不高,对不同氨基酸氧化效率差异可达3个数量级[59]。此外,利用物理法产生羟基自由基需要昂贵的设备,不易推广;而基于过氧化氢的FPOP方法和其他化学催化方法需要额外加入特定试剂,可能引起蛋白质构象的变化从而影响分析结果。

图4 通过FPOP测量肌红蛋白折叠期间的结构变化[64]Fig.4 Structural changes during apo-myoglobin foldingas measured by FPOP(fast photochemical oxidation of proteins)[64]A-H:helix chains of apo-myoglobin;ox:oxidation;t:time.

其他共价标记的方法利用特定化学试剂对蛋白质表面的氨基酸进行修饰,通过氨基酸反应性检测蛋白质结构。不同于HRF中羟基自由基需要专门设备产生,化学试剂直接添加到蛋白质溶液中进行标记反应。标记试剂可以分为两类,包括氨基酸特异性标记与非特异性标记。例如,二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)是一种非特异性的标记试剂,可通过亲核取代反应修饰多种亲核残基(半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸)的侧链和蛋白质的N端[68,69]。然而,一些修饰的残基,特别是丝氨酸和苏氨酸,在溶液中保留太久会发生水解,导致标记丢失,因此必须在标记反应完成后立即酶解和质谱分析[70]。TMT(tandem mass tag)基于琥珀酰亚胺基团可以特异性修饰赖氨酸侧链和蛋白质N端,根据标记反应的动力学信息可以获得蛋白质结构的相关信息[71]。此外,Cravatt课题组[72]设计了基于活性分子探针的蛋白质标记方法(activity-based protein profiling,ABPP)。活性分子探针由报告基团、反应基团和将二者相连的聚乙二醇链或者碳链组成,报告基团可以是生物素基团、荧光基团或者是便于引入新的化合物的正交反应基团等,反应基团一般是亲电小分子,用于选择性结合蛋白酶的活性中心并与具有重要催化功能的亲和氨基酸反应,从而将分子探针共价标记到蛋白质上[73]。Cravatt课题组[74,75]将该方法应用于人体细胞裂解液中蛋白质活性位点中半胱氨酸和赖氨酸的规模化鉴定,将活性分子探针作为竞争性抑制剂直接加入蛋白质组,从而定位靶标蛋白质和靶点,为小分子与蛋白质的相互作用、抑制剂的设计等提供指导。

目前常用的共价标记方法主要针对赖氨酸上的伯氨基团和半胱氨酸上的巯基,相关标记反应如琥珀酰化等可能引起蛋白质电荷、疏水性、结构的改变从而导致蛋白质失活[76,77]。此外,目前常用的标记反应试剂的物理化学性质较为复杂、尺寸较大、空间位置效应明显,只能探测蛋白质暴露于溶剂且没有较大位阻的区域,对于一些有较大位阻的蛋白质活性中心区域的结构变化难以探测。因此,基于共价化学标记的蛋白质组学结构分析方法目前仍面临挑战,亟须发展一种不改变蛋白质结构和生物活性的共价化学标记策略,同时降低标记试剂尺寸和空间位阻效应,使其可以探测蛋白质中位阻较大的活性中心区域,从而提高结构蛋白质组学分析的准确性。本课题组[78]发展了一种活性蛋白质二甲基化标记新方法用于研究膜蛋白质复合物中赖氨酸的反应性及其近程微环境(lysine proximal microenvironment,LPM)。由于标记试剂相对分子质量小(CH2O和NaBH3CN),能对蛋白质复合物中的几乎全部赖氨酸进行结构特异性差异标记;并且该反应不影响蛋白质电荷情况,在标记后蛋白质仍然能够保持生物学活性,实现了超大相对分子质量膜蛋白质复合物(700 kDa)中赖氨酸反应活性和近程微环境的高通量、全面分析。此外,本课题组[79]将该方法进一步应用于小分子配体对蛋白质受体的分子识别和结构调控机制解析,如图5所示,通过可视化赖氨酸反应性的变化值监测膜受体蛋白质的动态结构调节模式。相关结果证明,该方法不仅可以发现小分子与蛋白质的直接作用界面区域,还可以监测蛋白质发生了诱导构象变化的其他区域,为研究小分子配体的作用机制提供了一种全新的质谱分析方法,有望应用于靶向药物的筛选、评估和优化。

图5 完整蛋白质活性二甲基标记示意图[79]Fig.5 Schematic diagram of the active dimethyl labeling of intact proteins[79]

3.5 热稳定性分析法

图6 蛋白质组热稳定性高通量定量分析[81]Fig.6 Quantitative protein-wide profiling of protein thermal stability[81]TMT:tandem mass tag.

蛋白质组的热稳定性分析法(thermal proteome profiling,TPP)可以通过分析蛋白质不同构象/结构在高温下稳定性的差异高通量探测蛋白质的结构变化。蛋白质在高温下会发生部分变性聚集,从而导致在溶液中的含量减少,在细胞裂解液中添加小分子药物,通过定量蛋白质组学方法分析添加小分子前后蛋白质在不同温度下热稳定性的差异即可得到小分子药物的潜在作用底物蛋白质[80],见图6。Savitski等[81]利用该方法系统分析了小分子配体的靶向蛋白质底物,例如确定了激酶抑制剂staurosporine的50多个蛋白质靶点,如激酶PKN1 (protein kinase N1)和AURKA(aurora kinase A);观察到过钒酸盐诱导的T细胞受体信号传导中的热变化,影响ATP(adenosine triphosphate)结合膜蛋白ATP1A1和转运蛋白MDR1(multidrug-resistance transporter)[82];揭示了组蛋白去乙酰化酶抑制剂panobinostat对苯丙氨酸羟化酶的抑制作用[83];同时将该方法应用于蛋白质降解与合成的动态分析,例如揭示雷洛昔芬诱导雌激素受体TMEM97降解失调,影响胆固醇体内平衡调节剂等[84]。这种检测热稳定性变化的方法能有效鉴定药物的蛋白质底物,有助于系统研究药物功效和毒性。然而,该方法不能给出药物与底物蛋白质的具体结合位点和区域信息,不能用于小分子配体和底物蛋白质的分子识别和作用机制研究。

4 展望

基于质谱的结构蛋白质组学分析方法是常规结构生物学分析(XRD、NMR和cryo-EM)的重要补充。其特点在于不受所分析蛋白质样品的纯度、尺寸的限制,可以对复杂活性蛋白质样品进行高通量动态分析,特别适合分析活性蛋白质复合物在外界刺激如药物小分子结合时的结构/构象动态变化分子机制。结构蛋白质组学分析在探索蛋白质结构和相互作用方面有着广泛的应用前景,通过新方法新技术的开发有望将结构生物学进一步推向组学分析的新层次,能够更为深入地探索复杂生物分子之间的相互作用网络和结构/构象协同分子机制,从而更好地阐释各种生物学过程。要实现此目标,结构蛋白质组学分析还需要从以下几个方面进行创新和发展,包括:(1)由于质谱分析需要引入质量标签,因此需要发展在细胞或动物中进行活体标记的方法,包括新的标记试剂和新的标记反应,在不影响蛋白质活性、结构和生理状态下实现复杂体系中蛋白质特定氨基酸或某一类氨基酸的高效标记,通过标记的蛋白质区域和程度实现结构的动态监测;(2)在数据处理方面,需要在整合已有的X射线晶体衍射和电镜结构数据的基础上引入结构蛋白质组学分析数据,从而模拟蛋白质和蛋白质复合物结构的动态变化分子机制以及与其他生物分子的相互作用情况;(3)高通量的液相色谱-质谱技术的发展,进一步提高复杂样品中蛋白质分析的序列覆盖率,实现组学层次上蛋白质结构的全面动态分析;(4)质谱技术的进一步发展,实现复杂活性蛋白质组样品的直接质谱分析,也就是目前逐渐引起关注的非变性整体蛋白质组学分析(native top-down proteomics),这依赖于质谱分辨率的提高、检测相对分子质量范围的扩大、气相解离技术的进步以及对气相反应和解离机理与规律的进一步深入认识。

综上所述,结构蛋白质组学分析的序幕已经拉开,将成为化学、生物学、医药健康等多个领域交叉研究的热点。相信在不久的将来,基于质谱的结构蛋白质组学方法将在疾病相关蛋白质的功能分析和药物筛选等方面发挥越来越重要的作用。