血清外泌体的蛋白质组分析及其在骨质疏松中的应用

霍春晖,李英华,乔 智,尚 志,曹成喜,洪 洋,肖 华*

(1.微生物代谢国家重点实验室,上海交通大学生命科学技术学院,上海 200240;2.复旦大学附属第五人民医院,上海 200240;3.上海交通大学电子信息与电气工程学院,上海 200240)

外泌体是细胞分泌的具膜小体,尺寸在30～150 nm之间,具有稳定的双层膜结构,可以选择性地包裹大量生物活性物质,如蛋白质、脂质和核酸等[1,2]。外泌体属于细胞外囊泡,在进入细胞外微环境后,通过膜融合的方式,将内含的物质传递到受体细胞中,进行物质的交流和传递,可以反映人体的生理和病理状态[3,4]。据文献[5]报道,恶性细胞分泌的外泌体与疾病的发生发展密切相关,并影响正常细胞的功能,同时可以促进肿瘤的转移和血管的生成,或引起体内的免疫应答等功能。外泌体携带大量的蛋白质,目前的研究表明,外泌体蛋白质可用于多种疾病的临床诊断和机制研究。例如,乳腺癌患者血浆外泌体中RALGAPA2等蛋白质相对正常人显著上调,有望用于乳腺癌的早期分子筛查[6]。定量蛋白质组学分析表明,骨质疏松患者的血清外泌体参与抑制体内成骨细胞的生长过程[7]。因此,对外泌体蛋白质组进行深入研究,一方面可以更好地理解疾病的发生发展机制,另一方面可以为疾病的分子诊断和治疗提供支持,加速推进精准医疗。

随着人口老龄化程度的加重,骨质疏松症已日益成为我国严重的健康问题,给社会和家庭带来了巨大的负担[8]。骨质疏松症的发生是由于人体内负责骨吸收的破骨细胞与决定骨形成的成骨细胞之间的骨动态平衡被打破,当骨形成的能力弱于骨吸收的能力,会引起骨密度降低,导致骨骼微结构恶化,从而增加临床骨脆性骨折的发病风险[9,10]。由于骨量减少的过程往往非常缓慢且缺乏明显症状,患者在早期骨量减少阶段很难意识到疾病的存在[11],一般在骨折之后才会意识到严重性,但已错过了最佳的预防和治疗时机。

临床上常用双能X射线法测定人体骨密度,评估骨量状态和罹患骨折的风险并诊断骨质疏松。世界卫生组织对骨密度诊断骨质疏松症的评价是测定T值进行评估,T值的定义为(测定值-同性别同种族正常成人骨峰值)/正常成人骨密度标准差,通常当骨密度T值≤-2.5为时骨质疏松,当-2.5-1.0时为健康状态[12]。但是通常情况下,骨密度只能反映骨量的多少,很难体现骨质量的高低,如骨矿化等,所以骨密度诊断法有时不能很准确地判断骨量状态,且很难分辨患者在接受治疗后的骨平衡状态[13]。骨转换生化标志物的检测也经常用于骨质疏松症的诊断,如N-telopeptide、C-telopeptide等,对这些生化标志物含量的测定,在预后评价上有着更大的优势。通过观察这些物质的含量变化,可以更好地了解骨吸收和骨形成动态过程,用来评估骨平衡状态。但是这些体液中的标志物容易受到饮食、性别和体液内酶影响,灵敏度不是很高[14]。因此,急需发展特异性生物标志物,用于骨质疏松症的筛查,促进骨质疏松的预防和治疗。

外泌体蕴含丰富的蛋白质,有望作为骨质疏松症早期诊断标志物。对骨质疏松症患者血清外泌体的蛋白质组学进行研究,可以更好地从蛋白质水平去理解骨量流失过程,找出在骨质疏松症状态下发生变化的蛋白质,作为临床诊断特异性的标志物。本文对血清外泌体进行了分离分析和表征,对正常人、骨量减少患者和骨质疏松患者血清中的外泌体采用基于液相色谱-质谱的技术进行定量蛋白质组学分析,发现骨量减少过程中外泌体蛋白质组所发生了系统性变化,为骨质疏松疾病的筛查和诊断奠定了基础。

表1 入组样本的临床信息Table1 Clinical information of the enrolled samples

1 实验部分

1.1 血清样本的收集

本研究所用血清样本均由复旦大学附属上海市第五人民医院提供,样本提供者在样本采集前均签署了书面知情同意书,12例临床样本信息汇总见表1。所有实验方案和操作步骤均根据上海交通大学Bio-X伦理委员会批准的方案(IRB#M15017)进行。血液样本均按照批准的方案进行收集,具体步骤为,首先将收集的血液置于含促凝剂的离心管中,室温放置20 min直至部分凝固,然后以2 000 g的速度离心20 min,去除血细胞和血小板,最后将得到的血清分装到1.5 mL管中并置于-80 ℃冷冻储存,用于后续实验。

1.2 仪器、试剂与材料

血清外泌体蛋白质组分析采用液相色谱-质谱系统,包括纳升液相色谱(EASY nL Thermo,Fisher Scientific,USA)和四极杆超高分辨轨道阱质谱仪(Q Exactive Plus,Thermo Fisher Scientific,USA),用于蛋白质的定性和定量分析。超高速离心机(Beckman,USA)用于外泌体的分离富集。纳米粒径分析仪Nano Sight S300(Malvern,UK)用于外泌体粒径分布和浓度检测。透射电子显微镜(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)用于观察血清外泌体的形态。

质谱级乙腈和甲酸溶液购于Thermo Fisher Scientific公司(USA)。RIPA裂解液(Millipore,USA)用于外泌体的破膜处理和蛋白提取。Pierce®BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher Scientific,USA)用于总蛋白浓度的测定。测序级胰蛋白酶(Promega,USA)用于蛋白质的酶解。Fast Silver银染试剂盒(Beyotime,中国)用于SDS-PAGE蛋白胶条的染色。CD63(ImmunoWay,USA)、TSG101(Abcam,UK)和CD9(Abcam,UK)抗体用于血清外泌体的表征。

图1 血清外泌体的分离和蛋白质组学分析流程示意图Fig.1 Schematic diagram of the isolation and proteomicsanalysis of serum exosomes

1.3 血清外泌体的分离富集

血清外泌体的分离按照文献[15]方法进行,步骤如图1所示。首先将血清样本和PBS(phosphate buffered saline)溶液以1∶20(v/v)的比例充分混匀稀释,并以300 g的速度离心10 min去除血细胞和血小板,将上清以2 600 g的速度离心20 min去除沉淀。得到的上清在10 000 g的速度下离心60 min,去除微囊泡。对所得上清以100 000 g的速度离心120 min,得到血清外泌体,以PBS溶液对血清外泌体进行重悬洗涤,以100 000 g的速度离心120 min,重复洗涤步骤两次,弃去上清,得到最终的血清外泌体。将所得外泌体重悬在100 μL PBS溶液中,加入10 μL RIPA裂解液和10 μL蛋白酶抑制剂,置于冰上60 min进行破膜和蛋白质提取,采用BCA(bicinchoninic acid)法测定外泌体蛋白质浓度,并于-80 ℃下保存,以备使用。所有操作步骤均在4 ℃下进行。

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

分别将2 μg血清蛋白质和血清外泌体蛋白质点样进10%SDS-PAGE凝胶(GenScript,USA)中,以120 V电压运行70 min。预染色的蛋白标记物(Life technologies,中国)用来追踪蛋白质迁移,观察电泳情况。采用Fast Silver银染试剂盒进行染色,使用EPSON Perfection V700 PHOTO(EPSON,中国)扫描凝胶图像。

1.5 外泌体的纳米粒径分析

将分离富集的外泌体重悬于100 μL PBS溶液中,充分振荡混匀后,取10 μL,用超纯水稀释至1 mL,注入Nano-Sight S300纳米粒度分析仪中,按照标准流程进行粒径分布和浓度的测定。测试温度为4 ℃。每个样本的取样分析次数设定为3次。采用Nano-Sight NTA(V 3.2)软件对实验结果进行分析,取3次拟合结果。

1.6 外泌体的透射电镜分析

将分离富集的外泌体重悬于100 μL PBS溶液中,取10 μL滴在电镜测试的铜网上,室温下静置5 min,然后用滤纸吸去浮液,再用超纯水洗3次,待其风干之后加10 μL磷钨酸溶液于铜网上,静置染色2 min后用无尘滤纸吸去残液,室温下静置风干,制成电镜测试样本,上机分析。采用透射电镜(TecnaiG2 spirit Biotwin,USA)在80～120 kV下观察血清外泌体的形貌。

1.7 蛋白免疫印迹分析

采用蛋白免疫印迹对血清外泌体的标志性蛋白质进行检测,包括CD63(CD63 antigen)、TSG101(tumor susceptibility gene 101 protein)和CD9(CD9 antigen)。简要实验步骤为:(1)SDS-PAGE分离:分别取10 μg外泌体蛋白质和血清上清液蛋白质,上样到10% Bis-Tris蛋白质凝胶中,在120 V下电泳70 min。(2)转膜:将预先用乙醇活化好的PVDF膜准备好,采用湿转法在恒定电流200 mA的转膜缓冲液中迁移60 min,将SDS-PAGE胶上的蛋白质转移到PVDF膜上。(3)封闭:将PVDF膜用PBST(phosphate buffered saline Tween-20)溶液简单清洗后,加5%(质量分数)脱脂牛奶并在室温下轻微振荡,封闭60 min。(4)一抗孵育:按照抗体说明书推荐的比例用BSA溶液稀释一抗,与PVDF膜在4 ℃下孵育过夜。(5)二抗孵育:将一抗孵育过夜后的膜以PBST溶液洗涤3次,然后加入相应的二抗,在室温孵育1 h。(6)显色:加入ECL(electrochemiluminescence)显色液,反应几分钟之后,用EPSON显影仪器进行化学发光检测。

1.8 蛋白质酶解

采取FASP(filter-aided sample preparation)酶解方式进行蛋白质酶解[15]。具体实验步骤为,首先将外泌体蛋白质和5倍体积的50%(体积分数,下同)乙醇、50%丙酮和0.1%乙酸组成的有机溶液充分混匀,在-20 ℃下过夜。将得到的蛋白质沉淀溶解于60 μL 6 mol/L盐酸胍溶液中。加入2 μL DL-二硫苏糖醇(DTT),在60 ℃下还原60 min,然后加入10 μL吲哚-3-乙酸(IAA),在避光条件下烷基化40 min。将得到的蛋白质溶液转移到10 kDa过滤管中,并在4 ℃下以12 000 g的速度离心20 min以浓缩蛋白质,按酶:蛋白质=1∶20(质量比)的比例加入胰蛋白酶(Promega,USA),在37 ℃下反应16 h,将外泌体蛋白质充分酶解成肽段。

1.9 液相色谱-质谱条件和免标记定量分析

1.9.1液相色谱-质谱条件

采用纳升液相色谱-四极杆超高分辨轨道阱质谱仪对外泌体蛋白质进行定性和定量分析。将外泌体蛋白质的肽段重溶在0.1%甲酸水溶液中,取等量(1 μg)肽段样品进样到色谱系统中,以200 nL/min的流速通过15 cm长的分析型反相色谱柱(15 cm×75 μm,3 μm,C18,Thermo Fisher Scientific),运行120 min色谱梯度进行分离。流动相A为99.9%水和0.1%甲酸混合液,流动相B为80%乙腈水溶液和0.1%甲酸混合液。洗脱的梯度为0～25 min,2%～8%B;25～90 min,9%～20%B;90～106 min,20%～30%B;106～109 min,30%～95%B;109～117 min,95%B;117～119 min,95%～2%B;119～120 min,2%B。采用ESI正极模式,电喷雾电压为2.0 kV,离子源温度为275 ℃,选择质荷比在350～1 500之间且电荷数为2～7的母离子进行二级碎裂,采用数据依赖性扫描模式。母离子扫描分辨率设为70 000,自动增益控制(automa-tic gain control,AGC)为106,碰撞能量设置为28,在Orbitrap中以17 500的分辨率检测离子碎片。动态排除时间设置为30 s,在一个MS扫描之后交替进行20次MS/MS。

1.9.2质谱数据分析处理

对采集的质谱数据,通过MaxQuant软件进行分析处理,在Human SwissProt数据库(548208序列)中进行蛋白质鉴定。搜索条件设置为:最多允许2个胰蛋白酶漏切位点,氧化修饰和乙酰化修饰设为可变修饰,前体和碎片离子的质量误差分别为6 ppm(10-6)和0.5 Da。蛋白质鉴定的标准为:至少检测到2个特征肽段,p<0.05,且假阳率(FDR)小于1%。通过在MaxQuant中使用基于强度的绝对定量(intensity-based absolute quantification,iBAQ)对鉴定的肽段进行定量分析,将每种蛋白质的iBAQ对其所在样品总iBAQ值的贡献进行归一化处理,且至少根据该蛋白质的两个特征肽段iBAQ值来确定其相对丰度。计算差异蛋白质的变化倍数和p值,p<0.01表示组间存在显著差异变化,变化倍数大于2视为显著上调,小于0.5则表示显著下调。

2 结果与讨论

本文对血清外泌体进行了分离富集和表征,并对血清外泌体蛋白质组进行了定性分析。通过对正常对照组、骨量减少组和骨质疏松症的血清外泌体进行定量蛋白质组分析,发现骨质疏松相关蛋白质。

图2 血清外泌体的表征Fig.2 Characterization of serum exosomes a.Exosomes particle size distribution.b.Western blotting analysis of CD63 (CD63 antigen),TSG101 (tumor susceptibility gene 101 protein),and CD9 (CD9 antigen)in exosomes (Exo)and serum supernatant (Sup).c.Transmission electron microscope images of exosomes.

2.1 血清外泌体的分离富集和表征

血清样本黏度很高,且含有大量高丰度蛋白质,不利于外泌体分离,因此,在分离富集之前用PBS溶液按照1∶20的体积比对血清进行稀释,然后再进行差速分离。对分离富集得到的外泌体,分别进行纳米粒径分析、透射电镜分析和免疫印迹分析,表征结果如图2所示。从图2a外泌体的粒径分布结果可以看出,富集到的外泌体尺寸大小在30～150 nm之间,并且其粒径峰值在97 nm处。外泌体的浓度为2.05×109particles/mL。接着,采用免疫印迹方法对外泌体表面特异性标志物CD63、TSG101和CD9进行了验证,同时以血清上清蛋白质作为对照,结果如图2b所示,这3种标志物在外泌体蛋白质中的表达强度很高,但在血清上清中没有表达或表达量很低。最后对外泌体进行了透射电镜分析,直接观察其形貌,结果如图2c所示。血清外泌体的尺寸大小在100 nm左右,为椭圆形,符合外泌体的形貌特征。以上结果说明成功富集到了血清外泌体,所用外泌体分离流程可以用于后续骨质疏松实验。

2.2 血清外泌体的蛋白质组研究

对提取的外泌体蛋白质进行SDS-PAGE分析,以血清上清蛋白质作为对照,结果如图3a所示。从图中可以看出,外泌体的蛋白质轮廓与血清上清有显著不同。血清中的高丰度蛋白质在外泌体中都明显减少甚至消失,如70 kDa的血清白蛋白、55和25 kDa的免疫球蛋白重链和轻链。同时,外泌体中有许多血清上清中没有的特征条带,特别是在相对分子质量高于100 kDa的区域,可能是因为这些外泌体蛋白质携带大量的翻译后修饰[16]。采用液相色谱-质谱对外泌体蛋白质进行定性分析,3次技术重复的结果共鉴定到了179个外泌体蛋白质(见图3b)。为了分析这些外泌体蛋白质具有的分子功能、参与的生物过程以及在细胞中的定位,本文进行了基因注释分析(Gene Ontology,GO),如图3d所示。结果表明,外泌体蛋白质主要参与防御反应、蛋白质激活和免疫应答等生物过程,主要分布在细胞外区域和囊泡中,参与的分子功能主要有蛋白质结合和抗原结合等,这些结果与文献[17]报道基本一致。综上所述,血清外泌体具有自身的独特性,外泌体蛋白质组可以反映生理和病理变化。

图3 外泌体的蛋白质组学分析Fig.3 Proteomic analysis of serum exosomes a.SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)of exosomes and serum supernatant.Lane M:marker;lane Sup:serum supernatant;lane Exo:exosomes.b.Venn diagram of identified exosomes proteins.c.Venn diagram of exosomes proteins and ExoCarta database.d.Gene Ontology analysis of exosomes proteins.

2.3 血清外泌体蛋白质组在骨质疏松中的应用

进一步将血清外泌体蛋白质组应用于骨质疏松研究。将正常对照组(n=4)、骨量减少组(n=4)和骨质疏松组(n=4)的血清分别混合均匀,并分离富集血清外泌体。采用免标记定量蛋白质组学方法对3组外泌体蛋白质样品进行比较分析,每个样品进行3次技术重复。经MaxQuant软件分析和归一化,共鉴定到229个蛋白质,其中在正常对照组、骨量减少组和骨质疏松组中分别鉴定到188、224和185个蛋白质(见图4a)。对鉴定到的229个蛋白质和外泌体数据库ExoCarta进行了比对,结果显示有74.5%的蛋白质是外泌体蛋白质(见图3c)。定量比较分析结果显示,很多蛋白质在3组之间差异明显(图4b)。其中,骨量减少组相对正常对照组有71个上调、9个下调,骨质疏松组相对骨量减少组有5个上调、77个下调,而骨质疏松组相对正常对照组有6个上调、20个下调。

进一步对骨质疏松组和正常对照组之间变化倍数大于2或小于0.5的71个蛋白质进行了信号通路分析(ingenuity pathway analysis,IPA),结果鉴定到了这些蛋白质参与的10个典型通路(见图4c),包括整合素信号通路(integrin signaling)和肌动蛋白细胞骨架信号通路(actin cytoskeleton signaling)等。整合素信号通路是维持骨组织动态平衡过程的重要信号通路,可以通过调节骨细胞功能,包括增殖、发育、分化、细胞黏附、迁移和凋亡,参与骨组织的重建和骨平衡的维持[18]。整合素蛋白质还可以通过整合素信号通路来调节丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化来响应流体剪切力,调节成骨细胞的生长[19]。肌动蛋白细胞骨架信号通路以及该信号通路中关键蛋白质在骨细胞的生长和骨组织形成过程中扮演着重要角色,参与该信号通路的蛋白质Filamin A、Talin 1和Gelsolin在本研究中也得到质谱鉴定。已有研究表明,通过对成骨细胞中肌动蛋白细胞骨架信号进行抑制,会影响成骨细胞的功能,进而抑制骨组织形成和骨平衡状态[20]。这些结果表明,在骨质疏松患者血清外泌体中发现的关键蛋白质可能和骨量减少密切相关,这些蛋白质参与的信号通路有助于深入研究骨质流失的机制。

按照变化倍数在2倍以上的标准,筛选出在骨质疏松组或骨量减少组中变化显著的17个蛋白质,包括Integrin β3、Integrin α2β1、Talin 1和Gelsolin等(见表2),并对这些蛋白质进行了蛋白质-蛋白质相互作用分析。结果表明,这些蛋白质之间存在很强的相互作用(见图4d),它们很可能通过共同协作来行使功能,这也说明骨质疏松患者体内发生了系统性变化。例如,Integrin β3 (ITGB3)是破骨细胞中高表达的一种整合素蛋白质,对于破骨细胞中肌动蛋白环和皱褶膜的形成有着重要作用,是细胞骨架重排和破骨细胞功能活化必不可少的关键蛋白质。当Integrin β3信号增强会提高破骨细胞的活力,导致骨量下降并大大增加骨折的风险[21]。此外,Integrin β3蛋白还可以调节其他骨疾病(如骨瘤)中破骨细胞的功能[22],因此Integrin β3对研究骨质疏松症等骨疾病有着重要的意义。另一个重要的整合素蛋白Integrin α2β1 (ITGA2B),位于破骨细胞的皱褶边缘,对破骨细胞和骨组织结合能力有重要的作用,当用针对Integrin α2β1的抗体或反义寡核苷酸消耗掉Integrin α2β1后,可以显著降低破骨细胞的骨吸收能力[23]。Talin 1(TLN1)是一种相对分子质量是270 kDa的细胞溶质吸附蛋白质,可以连接肌动蛋白细胞骨架与整合素蛋白进而调控生物过程。在小鼠模型中,通过抑制Talin 1蛋白质的表达,可以增强破骨细胞对骨组织的吸收,进而导致骨量的下降[24]。这表明Talin 1可以抑制破骨细胞对骨组织的吸收,该蛋白质的研究对今后骨质疏松的诊断和治疗具有重要作用。人凝溶胶蛋白(gelsolin,GSN)是凝溶胶蛋白质家族的一种肌动蛋白结合蛋白质,与破骨细胞的生长过程和功能发挥有着密切联系[25]。已有研究[26]显示,Gelsolin蛋白在破骨细胞中足体和肌动蛋白环的生成过程起重要作用,进而对破骨细胞骨吸收能力产生影响,引起骨量的变化,有望作为骨质疏松症诊断的潜在标志物。此外,许多蛋白质在正常对照组、骨量减少组和骨质疏松组中呈现显著的变化趋势,或者持续下调,或者先上调再下调,如图5所示。这些蛋白质与骨量流失的相关性目前尚未见到文献报道,对这些重要蛋白质的研究有望为研究骨量流失疾病找到新的方向。

图4 外泌体蛋白质的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of identified exosomes proteins a.Venn diagram of proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.b.Differentially expressed proteins in the normal,osteopenia,and osteoporosis groups.N:normal;OA:osteopenia;OS:osteoporosis.c.Top 10 pathways enriched by IPA from the proteins that differentially expressed between the osteoporosis and normal groups.d.Protein-protein interaction analysis of 17 candidates.Protein names are the same as those in Table 2.

表2 骨量减少组和骨质疏松组中变化显著的17个候选蛋白质Table2 Seventeen candidates significantly dysregulated in the osteoporosis and osteopenia groups

Nor:normal.

图5 候选蛋白质在不同组别的表达趋势Fig.5 Protein expression trend in different groups a.Resistin,ferritin light chain,and histone H2B type 1-C/E/F/G/I.b.Fibrinogen alpha,gamma,and beta chains.iBAQ:intensity-based absolute quantification.c.Volcano plots from MaxQuant quantitative analysis of exosomes in the osteoporosis and normal groups.Red dot:significantly up-regulated proteins (p<0.05,fold change>2);green dot:significantly down-regulated proteins (p<0.05,fold change<0.5);black dot:no significant difference.FC:fold change.

3 结论

本文对血清外泌体进行了分离分析和表征,对血清外泌体蛋白质组进行了研究,并应用于骨质疏松症研究。通过定量比较正常对照组、骨量减少组和骨质疏松组在外泌体蛋白质表达上的差异,发现了与骨量流失相关的蛋白质与人体骨平衡和骨细胞的功能密切相关,虽然这些蛋白质有待进一步验证,但本研究提示血清外泌体蛋白质组有望作为骨质疏松症诊断和治疗的靶标。