针刀松解法对腰椎间盘突出症根性神经痛模型大鼠镇痛与抗炎效果分析

冯涛， 张丽萍

（1.菏泽市中医医院，山东菏泽 274000；2.山东中医药大学附属威海医院，山东威海 264200）

腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation，LDH）是腰腿痛最为常见的原因，是临床常见病，好发于30～50岁的体力劳动者或者平时缺乏锻炼的人群[1]。腰椎间盘突出等一系列的脊柱退行性病变均会对神经根造成不同程度的压迫，进而导致神经损伤并诱发神经传导阻滞，临床表现为慢性腰背痛与坐骨神经痛等症状，本病的根本病理变化在于病变部位神经根的损伤。而病变部位发生周围神经损伤之后，会造成背根结神经细胞凋亡增多，这种异常的神经细胞凋亡会影响到患者后期生理功能的恢复[2-4]。所以，在治疗过程中，减少神经损伤之后出现背根神经节神经元凋亡，具有十分重要的临床意义。本实验以腰椎间盘突出症根性神经痛模型大鼠为研究对象，通过针刀松解法治疗后，检测各组大鼠脊髓谷氨酸（Glu）、脊髓背角P物质（SP）、下丘脑β-内啡肽（β-EP）、血清白细胞介素1β（IL-1β）含量的变化，探讨针刀松解法对腰椎间盘突出症根性神经痛模型大鼠镇痛、抗炎效果与机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠40只，雄性，体质量240～270 g，由北京维通利华实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（京）2016-0003，饲养于北京中医药大学基础医学院实验动物中心二级实验室，室温维持在20℃。

1.2 主要试剂与仪器

水合氯醛，北京化学试剂厂，批号：160902；碘伏，武汉同济美迪生科技有限公司，批号：20160802；酒精，北京贞玉民生药液有限公司，批号：201607002；谷氨酸ELISA试剂盒、β-内啡肽ELISA试剂盒、白细胞介素-1β ELISA试剂盒和P物质ELISA试剂盒，均由北京尚柏生物科技有限公司提供。HZ系列一次性针刀规格为0.4 mm×40 mm，汉章牌，北京卓越华友医疗器械有限公司；LH202H型韩氏穴位神经刺激仪，北京华卫产业发公司；环球牌无菌针灸针，规格为0.2 mm×13 mm，苏州针灸医疗器材有限公司；5415R型高速离心机，德国Eppendorf公司；FS/FAS5030石蜡切片机，德国LETIZ公司；BX61显微镜，日本Olympus株式会社；PL-200型热痛测试仪检测盒，成都泰盟软件有限公司。

1.3 分组与模型制备[5]

大鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常组、模型组、针刀组和电针组，共4组，每组各10只。除正常组外，其余各组大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL/kg）进行腹腔麻醉，背部脱毛之后以俯卧位固定在铺有无菌手术巾的手术台上面；将手术区域暴露出来，用碘伏对大鼠暴露的手术部位进行消毒处理；将L3-4棘突作为中心区域，于大鼠背部正中部位取大约3 cm长的切口，依次切开大鼠背部的皮肤、皮下组织与腰背筋膜层；将其背部组织进行钝性分离，直至暴露腰椎旁肌；将其牵开后，用微型咬骨钳将左侧L4棘突及右侧椎板、关节突咬除，暴露L4神经根，以4-0铬制肠线环扎在L4神经根处，其松紧度以肠线接触到神经根但无明显压迫为宜。将切口进行逐层地缝合，并洒上青霉素粉末，术后3 d内每天给予大鼠青霉素肌注预防感染，剂量为8万U/d。

待大鼠清醒后，观察大鼠双下肢是否有瘫痪的情况出现（主要表现为步态不稳或者足外翻），以此来判定造模是否对大鼠造成了脊髓的损伤。如果没有瘫痪的情况，就对大鼠两侧的后足检测热刺激痛觉过敏情况：将大鼠放置在PL-200型热痛测试仪的检测盒之中，辐射热光源经过底部的玻璃板聚焦于大鼠一侧足底的后半部位，其光斑直径为5 mm。把大鼠从开始照射到产生缩爪的时间记录下来。每次测试间隔至少为5 min，测量3次取其平均值，对大鼠的两侧后足进行交替检测。根据各次检测的平均值求出大鼠两后足进行热刺激后发生缩爪的潜伏期，计算公式：缩爪的潜伏期=术前侧潜伏期-术后潜伏期。差值比正常组大鼠的差值大则说明潜伏期下降，对热痛反应发生了痛觉过敏现象，提示造模成功。

1.4 干预方法

正常组与模型组，均常规饲养。针刀组：造模3 d后，给予大鼠针刀干预治疗。施行针刀时先用乙醚将大鼠麻醉1 min，选用HZ系列一次性针刀进行干预，其治疗点选择于患椎上下棘之间、患椎上下棘间旁开0.1 cm处，患椎上下横突，臀上皮神经走行区域、坐骨神经出口处等部位的条索、结节、压痛点等位置，每次选择2-3个点进行松解。每周干预1次，共干预3次。电针组：造模3 d后，给予大鼠电针干预治疗。取大鼠的环跳穴、委中穴。参考《实验针灸学》[6]教材，并结合动物比较学方法进行取穴，依据比较解剖取穴法配合模拟骨度取穴法最终确定穴位的具体位置。选用一次性无菌针灸针，针刺后连接韩氏穴位神经刺激仪对大鼠进行电针刺激，频率为2～100 Hz，电流强度以造成大鼠后肢轻度抖动为宜，每次刺激20 min。隔天治疗1次，每周治疗3次，共治疗3周。

1.5 取材与检测指标

实验结束后24 h内取材，用10%水合氯醛溶液0.0375 mg/kg腹腔麻醉大鼠，快速取出其脊髓的L4-6段，分成2个部分。第一部分放置于液氮罐内冻存，以蔡尧辉毛细管电泳分析Glu含量的变化。第二部分放置于以4%多聚甲醛为主要成分的固定液中固定6～12 h后，梯度酒精脱水处理，用二甲苯进行透明处理；石蜡包埋后，作连续冠状切片，厚度约为5 μm，用于免疫组织化学方法分析SP含量的变化。

实验结束后，大鼠断头取血6 mL，4℃，离心机3 000 r/min离心15 min后，进行血清分离，放射免疫法进行大鼠IL-1β含量的测定。

快速分离大鼠脑组织，冰盘上分离出大鼠下丘脑，制成脑匀浆，以放射免疫法对大鼠下丘脑β-EP的含量进行测定。

1.6 统计方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，运用单因素方差分析，等级资料应用Ridit分析。组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA）。当方差分析有显著意义时，进行多组间两两比较；在方差齐时采用Bonferroni法，而方差不齐时采用Tamhane法。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓Glu毛细管电泳比较

表1结果显示：模型组大鼠脊髓Glu的含量明显上升，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；电针组和针刀组大鼠脊髓Glu的含量明显下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表1 各组大鼠脊髓Glu毛细管电泳比较Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

表1 各组大鼠脊髓Glu毛细管电泳比较Table 1 Comparison of the content of spinal Glu in various groups[±s，c/（μmol·L-1）]

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组电针组针刀组Glu 64.12±10.68 113.62±18.26①66.72±11.93②65.37±10.01②N 10 10 10 10

2.2 各组大鼠SP免疫组化结果比较

正常组大鼠P物质的免疫阳性反应物主要集中在脊髓的Ⅰ～Ⅱ层，模型组大鼠脊髓Ⅰ～Ⅳ层都能看到阳性反应物，见图1。模型组积分光密度升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；电针组与针刀组积分光密度明显改善，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠SP免疫组化结果比较Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

表2 各组大鼠SP免疫组化结果比较Table 2 Comparison of the SP immunohistochemical results in various groups （±s）

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组电针组针刀组积分光密度10.98±1.52 33.85±8.03①26.54±6.86②24.61±3.42②N 10 10 10 10

图1 各组大鼠P物质的免疫阳性反应物（免疫组化，×100）Figure 1 Comparison of the positive immune reactants of substance P in various groups（by immunohistochemical method，×100）

2.3 各组大鼠下丘脑β-EP及血清IL-1β含量比较

表3结果显示：模型组大鼠下丘脑中β-EP及血清IL-1β的含量均明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。电针组与针刀组大鼠下丘脑中β-EP及血清IL-1β的含量均明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表3 各组大鼠下丘脑β-EP及血清IL-1β含量比较Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

表3 各组大鼠下丘脑β-EP及血清IL-1β含量比较Table 3 Comparison of the contents of hypothalamic β-EP and serum IL-1β in various groups[±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组电针组针刀组IL-1β 0.41±0.06 0.71±0.42①0.44±0.32②0.42±0.06②N 10 10 10 10 β-EP 104.31±45.63 172.13±40.76①112.72±26.65②110.15±28.69②

3 讨论

针刀疗法是一种治疗慢性软组织损伤的新疗法，其将传统针灸方法与西医外科手术刀相结合，能够松解黏连、刮除瘢痕、消除痉挛，恢复软组织的动态力学平衡。电针是一种对传统针灸学的继承与发扬，它结合了针与电两种刺激手段，能够有效地提高临床疗效，且可以较为准确地掌握刺激参数，并代替了手法运针，节省人力，故目前广泛地应用于针灸治疗当中。

谷氨酸（Glu）广泛存在于中枢神经系统之中。研究[7]发现，Glu能够促进炎性痛敏的发生，且对痛敏的维持起到关键的作用，如果抑制Glu释放或者拮抗Glu与其相应的受体发生结合都能够有效地抑制痛敏的形成，明显减轻疼痛反应。本实验结果表明，模型组大鼠脊髓中Glu的含量较正常组明显上升，这表明Glu在痛敏及突触可塑性改变过程中起着极为重要的作用，这与之前的研究结果基本一致；而电针或者针刀刺激能够使脊髓Glu的含量有所下降，提示脊髓Glu含量的降低很可能是电针或者针刀镇痛的机制之一。

P物质（SP）及其受体广泛分布于脊髓的Ⅰ层、Ⅱ层与Ⅹ层，并参与疼痛信息的传递[8，9]。通过细胞毒的作用，使脊髓背角表达SP受体的神经元有所减少，能够有效地抑制脊髓背角细胞的中枢敏化，这意味着SP是影响痛敏形成与发展的主要因素[10]。本实验结果显示，模型组大鼠脊髓中SP的免疫阳性反应初级传入纤维末梢和背角神经元释放的SP增多，而电针组和针刀组SP的积分光密度较模型组明显下降，说明电针或者针刀对于炎性痛的环节很可能是通过抑制脊髓背角中SP的释放以阻断痛觉信号的传递来实现的。

β-内啡肽（β-EP）是由其自身合成的具阿片样作用的肽类物质，是机体镇痛系统的主要递质，可以在中枢与外周两处位置发挥作用[11]。在中枢神经系统中，β-EP通过β-内啡肽能神经元的神经纤维投射到其相应核团部位以抑制疼痛信息的传递，比如脊髓背角痛觉信息传递的抑制作用；在外周，因为垂体与免疫细胞能够分泌大量的β-EP入血，这主要通过损伤应激组织以缓解疼痛的发生。研究[12]发现，β-EP的镇痛作用主要是通过含β-EP的免疫细胞迁移到炎症组织中，促进β-EP的释放，以激活感觉神经元周围末梢上的阿片受体而发生镇痛效果。本实验结果显示，电针或者针刀刺激都能够使下丘脑β-EP的含量显著下降，提示经过电针或者针刀治疗，大鼠病变局部的血液循环得到了改善，其神经根的水肿与脱髓鞘变化有所缓解，在病变过程中多种炎症介质的释放有所减少，组织间的代谢得到了加快，这使得炎性物质的转运与降解加速，这一过程与整个神经—内分泌—免疫网络发生协同作用，从而降低了β-EP的含量。

白细胞介素-1β（IL-1β）是神经与免疫系统之间较为重要的一种传递物质，在神经与免疫系统之间起着重要的调节作用，所以被称作免疫神经递质，同时，它也是炎症形成的中心环节[13，14]。研究[15]发现，腰椎间盘突出组织当中IL-1β的含量与根性疼痛呈正相关。本实验结果表明，经过电针或者针刀治疗，大鼠血清IL-1β的含量较模型组显著下降，提示电针或针刀对腰椎间盘突出所诱发的炎症反应能够起到有效的良性调节作用，治疗后通过减少血清中IL-1β的表达，以使炎症细胞的聚集、激活及炎症介质的释放有所减少，减轻白细胞和内皮细胞之间的黏附反应，使得白细胞浸润情况的发生减少，以减缓炎症反应的程度与进程，从而缓解疼痛的症状。

本实验结果显示，模型组大鼠脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘脑β-EP、血清IL-1β的含量明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；电针组与针刀组脊髓Glu、脊髓背角SP、下丘脑β-EP、血清IL-1β表达水平明显下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明针刀和电针治疗均可明显改善腰椎间盘突出症根性神经痛症状，且针刀效果略优于电针。

本实验提示针刀松解法、电针疗法对腰椎间盘突出症根性神经痛有明显的抗炎与镇痛作用。针刀松解法治疗腰椎间盘突出症根性神经痛在局部松解作用的基础上，还通过对神经根的直接刺激作用，经神经纤维的传导，激发下丘脑—垂体—肾上腺轴的调节，从神经、体液、免疫三个方面共同作用，抑制或减少化学性致痛因子的释放，同时加速血液循环促进致痛因子的代谢，加速神经水肿的吸收及无菌炎症的消退，从而减轻疼痛刺激，缓解症状[16-18]。本研究以电针组进行对比，以神经电生理、疼痛物质变化为切入点，通过实验探索针刀治疗LDH的作用机制，进一步剖析了LDH发病机制、病理转变，从而有针对性地指导和完善LDH的临床诊疗方案，同时也为针刀治疗LDH的作用机制提供了实验支持，完善了其理论研究。