KBN触变凝胶剂对非感染性炎症模型动物的抗炎作用及机制研究

黄祖波， 沈崇坤， 冯会婷， 侯雪楠， 吴文如， 张军

（1.广州中医药大学中药学院，广东广州 510006；2.广州中医药大学基础医学院，广东广州 510006；3.广州中医药大学附属中山中医院，广东中山 528400；4.广州中医药大学第四临床医学院，广东广州 510006）

KBN触变凝胶剂[1]是本课题组立足于“优化处方，优化剂型”对治疗外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）的中药新药开展持续研究而获得的一种新型中药制剂。该制剂由黄连、三白草、鸡冠花、大青叶、苦参、百部、龙胆、香薷、丁香、冰片10味中药材组成，具有清热解毒、祛湿止带、杀虫止痒之功，临床用于治疗霉菌性阴道炎。前期研究已证实该制剂具备优良的抑杀白色念珠菌功效，但其抗炎效果及作用机制尚不明确。抗炎作用是新药药效学评价的重要组成内容。基于此，本研究拟通过建立大鼠足肿胀模型及小鼠急性耳肿胀模型，评价KBN触变凝胶剂的抗炎作用，并从核因子kappaB（NF-κB）信号通路调控局部组织中炎症相关蛋白和因子的表达水平，初步探讨其作用机制，以期为KBN触变凝胶剂的临床开发应用提供科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠，180～220 g，SPF级KM雌性小鼠，18～22 g，均由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2013-0034。

1.2 药物及试剂 凝胶基质KBN触变凝胶剂为南方医科大学珠江医院中试研究制备产品；地塞米松（华润三九医药股份有限公司，批号：1802013H）。角叉菜胶（美国Sigma公司，批号：SLBR0530V）；大鼠血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20180619、20180616）；RIPA Lysis Buffer（CWBIO公司，批号：01408/40313）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠抗兔二抗（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，批号：77K00113）；十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（联科生物，批号：71708373）；核因子NF-κB p65抗体（批号：AF5006）、抑制因子 IκB-α 抗体（批号：AF5002）、COX-2抗体（批号：AF7003）、Tubulin抗体（批号：AF7010）、GAPDH抗体（批号：AF7021）均购自于美国Affinity公司；水合氯醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20140412）；二甲苯（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20160201-2）；4%多聚甲醛（合肥biosharp公司，批号：1807949）；OCT包埋剂（日本Sakura公司，批号：4583）；EDTA（pH9.0）抗原修复液（武汉Servicebio公司，批号：G1203）；DAB显色剂组化试剂盒（武汉Servicebio公司，批号：G1211）。

1.3 仪器 PV-200型足容积测定仪（成都泰盟软件有限公司）；KOC-220HR型低温冷冻离心机（科大创新股份有限公司）；酶标仪（美国PerKinElmer公司）；电泳仪、湿法电转装置、化学发光仪（美国Bio-Rad公司）；ZD-8800型水平脱色摇床（华利达实验仪器公司）；匀浆机（美国Sonics公司）；PB-303N型电子天平（美国Mettler-Toledo公司）；老皮匠牌6 mm耳片打孔冲头；微量进样器（上海高鸽工贸有限公司）；PB-303N型电子天平（美国METTLER TOLEDO公司）；JJ-12J型脱水机、JBP5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；XSP-C204型显微镜（重庆光电仪器有限公司）。

1.4 抗大鼠足跖肿胀实验 参照文献[2，3]方法，将60只大鼠随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组（涂抹凝胶基质）、地塞米松组（涂抹复方醋酸地塞米松乳膏），KBN低、中、高剂量组（涂抹KBN触变凝胶剂，生药质量浓度分别为0.1、0.2、0.4 g·mL-1）。实验时，将各组大鼠右后肢外侧脱毛处理后，空白组不作任何处理，其他各组右后下肢外侧涂抹相应的药物。给药后用医用胶布覆盖1 h，每天3次，连续7 d。末次给药后1 h，使用足容积测定仪测量每只大鼠右后足正常足容积（V/mL）作为致炎前（0 h）数据，随后将1%角叉菜胶（0.1 mL/只）注入大鼠右后足脚垫皮下，再分别测量致炎后0.5、1、2、3、4、6 h大鼠右后足容积。致炎6 h完毕后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（剂量：0.3 mL/100 g体质量），腹主动脉取血，分离血清，剥离足部致炎部位软组织，样本于-80℃保存备用。按以下公式计算各个时间点的足肿胀度：足肿胀度=致炎后足容积-致炎前足容积。

1.5 采用酶联免疫吸附分析（ELISA）检测足跖肿胀模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量 取足跖肿胀模型大鼠血清解冻后3 000 r·min-1离心30 s，具体操作步骤严格按照TNF-α、IL-1β检测试剂盒说明书进行。

1.6 采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测足跖肿胀模型大鼠足部软组织 NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达 称取适量足跖肿胀模型大鼠足部软组织，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白总浓度。取蛋白上样量50 μg，以10%SDSPAGE后湿法转膜，50 g/L脱脂牛奶封闭1.5 h，洗涤。加入兔抗鼠NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、 COX-2（1∶1 000）、 Tubulin（1∶5 000）、GAPDH（1∶5 000）多克隆抗体，并置于4℃振荡孵育过夜。PBST洗涤3次，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h。PBST洗涤3次，HRP化学发光底物曝光，用化学发光仪检测显影并采集保存图像数据，用Image Lab图像分析软件，分析条带蛋白灰度值。

1.7 抗小鼠耳廓肿胀实验 参照文献[4]方法，取60只小鼠，称质量后随机分成6组，分组方法同“1.4”项。于每只小鼠右耳廓的内外两面均匀涂搽对应药物溶液约0.05 mL/20 g体质量，每天3次，连续7 d。末次给药30 min后，用蒸馏水洗去右侧耳廓药液并拭干，吸取二甲苯40 μL均匀涂布于小鼠右耳两面引起炎症30 min。将小鼠断颈处死，迅速剪下左、右两耳，用直径6 mm打孔冲头于相同位置打下两侧圆形耳片，称质量记录后浸入40 g/L多聚甲醛固定48 h备用。

1.8 免疫组织化学法检测小鼠耳廓组织中NF-κB p65及IκBα的表达 取耳片组织，梯度酒精脱水、透明，石蜡包埋，切片，然后进行抗原修复，血清封闭。加入抗体孵育：一抗为兔抗鼠NF-κB p65、IκBα多克隆抗体，稀释浓度均为1∶100，二抗为HRP标记山羊抗兔IgG，稀释浓度为1∶200。DAB显色后复染细胞核，最后脱水封片，显微镜镜检，图像采集分析。图像分析判读：苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色，在高倍视野（40×10）的光镜下，随机选择10个具有代表意义的视野，计算每个视野100个细胞中的阳性细胞（取均数），并观察细胞显色深浅。

1.9 统计方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析。方差齐时，组内两两多重比较采用LSD检验；方差不齐时，组内两两多重比较采用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KBN触变凝胶剂对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响 表1结果显示：与空白组比较，模型组大鼠足容积随时间逐步增大；造模后0.5～6 h，与模型组比较，KBN高剂量组大鼠足肿胀度降低（P＜0.05或P＜0.01），KBN低剂量和中剂量组有减小趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。KBN各剂量组足肿胀度与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明KBN触变凝胶剂对角叉菜胶致大鼠足肿胀具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。

2.2 KBN触变凝胶剂对足跖肿胀模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影响 表2结果显示：与空白组比较，足跖肿胀模型组大鼠足部软组织中TNF-α、IL-1β含量显著增高（P＜0.01）；与模型组比较，KBN高剂量组大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量显著降低（P＜0.05），KBN中剂量组大鼠血清中IL-1β含量显著降低（P＜0.05），KBN中剂量大鼠血清TNF-α含量及低剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量有一定的降低趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。表明0.2～0.4 g·mL-1KBN触变凝胶剂涂抹给药能较好抑制角叉菜胶诱导的促炎因子释放，且呈剂量依赖性。

表1 KBN触变凝胶剂对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

表1 KBN触变凝胶剂对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响Table 1 Effect of KBN thixotropic gel on carrageenan-induced paw edema in rats （±s，V/mL）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

组别空白组模型组地塞米松组KBN低剂量组KBN中剂量组KBN高剂量组造模后6 h 0.00±0.02 1.04±0.31①0.79±0.14③1.01±0.14 0.98±0.10 0.89±0.16②足肿胀度0 h 000000造模后0.5 h 0.00±0.01 0.42±0.17①0.25±0.19③0.44±0.09 0.45±0.20 0.30±0.19②造模后1 h 0.00±0.02 0.69±0.32①0.43±0.16③0.65±0.13 0.68±0.25 0.51±0.20②造模后2 h 0.00±0.02 0.86±0.30①0.55±0.16③0.80±0.14 0.80±0.27 0.77±0.27②造模后3 h 0.01±0.02 0.98±0.31①0.67±0.18③0.88±0.16 0.91±0.22 0.79±0.26②造模后4 h 0.00±0.02 1.08±0.33①0.83±0.18③0.97±0.23 0.96±0.22 0.89±0.17②

表2 KBN触变凝胶剂对足肿胀模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

表2 KBN触变凝胶剂对足肿胀模型大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响Table 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of TNF-α and IL-1β in serum of paw edema rats[±s，ρ/（ng·L-1）]

①P＜0.01，与空白组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

IL-1β 61.75±19.97 245.37±66.86①111.74±39.86③163.01±77.90 152.65±34.77②149.85±43.75②组别空白组模型组地塞米松组KBN低剂量组KBN中剂量组KBN高剂量组N 10 10 10 10 10 10 TNF-α 29.0±3.20 155.91±16.37①117.16±17.50③143.84±27.50 130.81±15.68 123.56±17.23②

2.3 KBN触变凝胶剂对足肿胀模型大鼠足部软组织NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达的影响 图1、表3结果显示：与空白组比较，角叉菜胶致足跖肿胀模型组大鼠足部软组织中NF-κB p65、COX-2表达显著增高（P＜0.05），IκBα表达显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，KBN高剂量组大鼠足部软组织中NF-κB p65、COX-2表达显著下降（P＜0.05或P ＜0.01）、IκBα表达显著上升（P＜0.05），KBN中剂量和低剂量组NF-κB p65、COX-2表达有下降趋势，IκBα表达有上升趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。KBN各剂量组大鼠足部软组织NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明NF-κB/IκB信号通路可能介导了KBN触变凝胶剂的抗炎作用，且呈剂量依赖性。

图1 KBN触变凝胶剂对足跖肿胀模型大鼠足部软组织NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达的影响Figure 1 Effect of KBN Thixotropic Gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats

表3 KBN触变凝胶剂对足跖肿胀模型大鼠足部软组织NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达的影响Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

表3 KBN触变凝胶剂对足跖肿胀模型大鼠足部软组织NF-κB p65、IκBα、COX-2蛋白表达的影响Table 3 Effect of KBN thixotropic gel on expression of NF-κB p65，IκBα and COX-2 in paw edema rats （±s）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

COX-2/GAPDH 0.123±0.021 0.918±0.048①0.665±0.197③0.860±0.101 0.857±0.115 0.715±0.085②组别空白组模型组地塞米松组KBN低剂量组KBN中剂量组KBN高剂量组N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65/GAPDH 0.233±0.025 0.803±0.059①0.400±0.092③0.640±0.099 0.600±0.027 0.503±0.084②IκBα/Tubulin 0.943±0.055 0.208±0.029①0.868±0.120③0.313±0.042 0.463±0.010 0.508±0.154②

2.4 KBN触变凝胶剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 表4结果显示：与空白组比较，模型组小鼠耳肿胀程度显著增大（P＜0.05）；与模型组比较，KBN高剂量组小鼠耳廓肿胀程度降低（P＜0.05）。KBN各剂量组小鼠耳肿胀程度与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明KBN触变凝胶剂对二甲苯所致的小鼠急性炎症耳肿胀具有抑制作用。

表4 KBN触变凝胶剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

表4 KBN触变凝胶剂对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响Table 4 Effect of KBN thixotropic gel on ear edema degree of mice induced by dimethyl benzene （±s）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

耳廓肿胀度（m/mg）0.233±0.224 6.167±1.905①0.533±0.312③5.189±2.504 4.233±1.973 3.900±1.491②组别空白组模型组地塞米松组KBN低剂量组KBN中剂量组KBN高剂量组N 10 10 10 10 10 10

2.5 KBN触变凝胶剂对耳廓肿胀模型小鼠耳部组织中NF-κB p65及IκBα表达水平的影响 图2、图3、表5结果显示：与空白组比较，模型组小鼠耳廓组织中NF-κB p65表达水平显著增高（P＜0.05）、IκBα表达水平显著降低（P ＜ 0.01）。与模型组比较，KBN高、中剂量组的小鼠耳廓组织中NF-κB p65表达水平显著降低（P＜0.05），KBN低剂量组NF-κB p65表达有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，KBN高剂量组的小鼠耳廓组织中IκBα表达水平显著增高（P＜0.05），KBN中、低剂量组IκBα表达亦有增高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；KBN各剂量组小鼠耳部组织NF-κB p65、IκBα表达与地塞米松组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明KBN触变凝胶剂可降低局部炎症组织中NF-κB p65的表达，上调IκBα的表达，从而达到抗炎效果，且呈剂量依赖性。

图2 KBN触变凝胶剂对耳廓肿胀模型小鼠耳组织NF-κB p65表达的影响（免疫组织化学法，×200）Figure 2 Effect of KBN thixotropic gel on the expression of NF-κB p65 in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

图3 KBN触变凝胶剂对耳廓肿胀模型小鼠耳组织IκBα表达的影响（免疫组织化学法，×200）Figure 3 The effect of KBN thixotropic gel on the expression of IκBα in ear tissues of ear edema mice（by immunohistochemical method，×200）

3 讨论

KBN触变凝胶剂以“清热解毒、利湿收敛、杀虫止痒”遣药组方，方中重用黄连，佐以龙胆、百部、苦参、丁香、大青叶等多味中药材，黄连的用量达到其发挥体外抗菌最佳药效的适宜量。临床应用中，KBN触变凝胶剂具有良好的抗炎消肿效果，能明显改善妇科阴道炎、皮肤软组织炎症、接触性皮肤炎等的炎症症状。现代医学表明，KBN触变凝胶剂复方中一些活性成分具有明显的抗炎作用，如小檗碱、丁香酚、黄芩苷、苦参碱等[5-8]。但KBN触变凝胶剂在药理实验中具有的抗急性炎症效果及抗炎机制尚不明确。

表5 各组小鼠耳廓组织中NF-κB p65及IκBα表达比较Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/个）

表5 各组小鼠耳廓组织中NF-κB p65及IκBα表达比较Table 5 Comparison of the expression levels of NF-κB p65 and IκBα in mouse ear tissues of various groups（±s，n/个）

①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

IκBα阳性细胞数20.3±3.0 7.6±2.9①16.7±11.0③9.0±4.3 12.5±6.2 13.6±5.0②组别空白组模型组地塞米松组KBN低剂量组KBN中剂量组KBN高剂量组N 10 10 10 10 10 10 NF-κB p65阳性细胞数2.0±0.7 14.4±3.4①3.6±1.1③10.0±2.4 6.5±2.5②4.8±2.2②

炎症反应是机体对损伤因子所产生的一种特异性防御反应，在损伤组织和血液中伴随着复杂的多种炎症介质以及炎症相关通路蛋白表达水平的波动[9]。在众多促炎性因子中，白介素-1β和肿瘤坏死因子-α是其中的关键因子[10]。TNF-α是由巨噬细胞、单核细胞经致炎因子刺激后所释放的一种细胞因子，是一种促炎症蛋白；IL-1β是一种炎性活细胞素，具有广泛的生物学效应，可刺激各种免疫细胞和炎症细胞，促进炎症蛋白和炎症介质的释放，对中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞有趋化作用，增强炎症反应。环氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成过程中的关键酶，包括COX-1/COX-2 2种存在形式，其中COX-2为诱导型，是经刺激迅速产生的诱导酶，由各种损伤性化学、物理和生物因子均可诱导产生[11]，进而催化PGs合成，参与并持续影响炎症反应的发生和发展。

NF-κB信号通路是一条与炎症反应关系密切的信号通路。正常生理条件下，NF-κB与它的抑制蛋白（IκB）相结合在胞浆内以无活性形式存在，当外界环境发生变化时，Akt作为其重要的上游分子，可通过磷酸化IκB激酶促使后者降解IκB，使NF-κB与IκB分离并活化最终转移至细胞核调节转录，进而调节多种分子如炎症介质、趋化因子、酶类等的表达，调节着炎症反应的进程[10]。抑制NF-κB信号通路，可抑制促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β）、黏附因子、趋化因子、凝血因子等的过度合成与释放，并且抑制与炎症有关的基因表达，保护机体免受过度炎症的伤害，因此，NF-κB被认为是多种炎症因子转录调控的中心环节。

本课题组前期研究已通过体外抗真菌药敏试验证实了KBN触变凝胶剂在大于13.03 mg/mL生药浓度时对白色念珠菌具有较佳的抑制作用，透射电镜结果表明其可能是通过破坏白色念珠菌的细胞壁、细胞膜的结构而达到抗真菌作用。基于此，本研究从抗炎的角度进一步展开对KBN触变凝胶剂的药效研究。角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型和二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型是目前运用较多且成熟的2种抗炎性药理模型，常用于筛选和评价药物的抗炎作用，尤其是在我国传统药物的抗炎作用研究中起到了重要的作用[12]。本研究成功复制了角叉菜胶致大鼠足跖肿胀模型和二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型，通过与模型组比较，KBN触变凝胶剂组足肿胀度与耳肿胀度显著降低，具有确切的抗炎药效。本研究进一步通过检测NF-κB信号通路中关键蛋白与相关炎症因子的表达水平探讨其作用机制。结果显示，与模型组比较，KBN触变凝胶剂干预后大鼠血清中TNF-α、IL-1β的表达水平均呈剂量依赖性下降，提示KBN触变凝胶剂的抗炎作用与抑制炎症因子TNF-α、IL-1β释放有着密切关系。结果还表明KBN触变凝胶剂能明显抑制炎症模型动物NF-κB p65、COX-2的表达，上调IκBα表达，推测抑制NF-κB通路活化及COX-2表达，进而减轻局部组织炎症反应，此极有可能是KBN触变凝胶剂发挥抗炎作用的主要机制之一。

综上所述，KBN触变凝胶剂具有良好的抗炎作用，其机制可能与抑制NF-κB信号通路活化进而降低炎症因子的释放有关。