醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠认知功能和神经元损伤的影响

李秀菊， 高源， 赵雪， 王领， 宗传赪

（武汉市第八医院麻醉科，湖北武汉 430010）

术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指术后学习能力、记忆力、执行力以及认知能力等受到损伤。大多数患者可在术后3个月后恢复，极少数患者为永久性认知功能障碍，是老年患者最为常见的术后中枢神经系统并发症，对术后康复以及生活质量产生严重影响[1，2]。以往研究报道术后早期的POCD与细胞因子介导的炎症反应、氧化应激、神经元凋亡以及中枢神经系统退行性等密切相关，临床上尚缺乏有效的治疗药物[3]。醒脾解郁汤是基于对认知功能障碍肝郁脾湿病机的认识而拟定的有效方剂。本研究通过观察醒脾解郁汤对模拟POCD的肝部分切除老年小鼠模型的学习记忆行为和细胞凋亡以及神经细胞标志物表达的影响，探讨醒脾解郁汤对POCD的影响及其分子机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，鼠龄18个月，体质量30～35g，购自湖北省疾控中心。动物质量合格证号：42816300002523。于华中农业大学完成实验。所有小鼠适应性喂养1周后开始实验。实验过程中小鼠的处理严格遵循动物福利与伦理准则和指南的相关规定。所有小鼠被随机分为5组，即假手术组、肝切除组及醒脾解郁汤低、中、高剂量组，每组8只。

1.2 药物、试剂与仪器 醒脾解郁汤由石菖蒲10 g、西洋参15 g、郁金12 g、熟地黄15 g组成，各中药材购自湖北天济中药饮片有限公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量试剂盒和RIPA裂解液（武汉Bio-swamp公司）；兔抗caspase 3多克隆抗体、兔抗Bax单克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗神经元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）多克隆抗体和兔抗胶质纤维酸性蛋白（gelatinous fiber acid protein，GFAP）单克隆抗体（英国Abcam公司）；兔抗GAPDH多克隆抗体（美国Proteintech公司）。SMART 3.0小动物行为视频分析系统（西班牙PANLAB公司）；电泳仪（美国Bio-Rad公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）；Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能公司）。1.3 模型建立 根据文献[4，5]方法建立肝叶部分切除术小鼠模型。具体步骤：肝切除组，醒脾解郁汤低、中、高剂量组小鼠给予腹腔注射0.2 mg/kg芬太尼和5 mg/kg氟哌利多，待小鼠的翻正反射消失后进行固定。对小鼠腹部进行消毒，在剑突下切开2 cm，打开小鼠腹腔分离其肝脏左外侧叶，用7号丝线在远端蒂部进行结扎，将结扎外侧的肝脏组织切除，彻底止血后用3号丝线对切口进行逐层缝合，并进行常规消毒。假手术组小鼠进行手术但不切除肝叶。

1.4 给药 醒脾解郁汤低、中、高剂量组小鼠于术前6 d开始至术后2 d每天分别灌胃3.6、7.2、14.4 g·kg-1·d-1的醒脾解郁汤，假手术组和肝切除组小鼠灌胃等体积生理盐水。药物剂量换算根据文献[6]计算得出。

1.5 水迷宫实验 所有小鼠于术前6 d开始进行水迷宫训练，每天4次。每次让小鼠面向池壁入水，令其寻找置于第Ⅰ象限水面下1 cm处的平台，所耗时间记为逃逸潜伏期。本实验设定最大时限为90 s（即在90 s内未找到平台者停止记录，并将逃逸潜伏期记为90 s）。术后第2天撤去平台，选取原平台正对象限为动物入水点，让动物自由游泳90 s，记录90 s内动物穿过平台区的次数，并记录逃逸潜伏期。

1.6 Western Blot实验 对各组小鼠的海马组织进行蛋白提取，采用BCA法进行蛋白浓度测定。每孔上样30 μL蛋白样品，12%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转印至PVDF膜上。0.5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗涤后分别加入一抗（caspase 3稀释比：1∶500；Bax稀释比：1∶2 000；Bcl-2稀释比：1∶2 000；NeuN稀释比：1∶1 000；GFAP稀释比：1∶10 000），4℃孵育过夜。TBST再次洗涤后，加入HRP标记的特异性二抗IgG室温孵育1 h，洗膜。ECL化学发光试剂曝光显影，拍照保存。

1.7 统计方法 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组的组间比较采用单因素方差，均数间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠认知功能的影响 表1结果显示：手术后第2天，与假手术组小鼠比较，肝切除组小鼠的逃逸潜伏期明显延长，小鼠穿越平台的次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与肝切除组小鼠比较，醒脾解郁汤低、中、高剂量组小鼠的逃逸潜伏期显著缩短，小鼠穿越平台的次数显著增多，且呈剂量依赖性。

表1 醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠认知功能的影响Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

表1 醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠认知功能的影响Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与肝切除组比较；③P＜0.05，与醒脾解郁汤低剂量组比较

穿台次数（n/次）8.51±0.73 4.22±0.65①5.91±0.67①6.46± 0.82①②7.57± 0.97②③组别假手术组肝切除组醒脾解郁汤低剂量组醒脾解郁汤中剂量组醒脾解郁汤高剂量组N88888逃逸潜伏期（t/s）27.57±4.54 39.18±3.76①35.79±3.87①33.09± 3.72①②30.71± 3.83②③

2.2 醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠凋亡相关蛋白的影响 图1结果显示：与假手术组比较，肝切除组小鼠海马组织中Bax、caspase 3蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与肝切除组比较，醒脾解郁汤低、中、高剂量组小鼠海马组织中Bax和caspase 3蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

2.3 醒脾解郁汤对肝部分切除老年小鼠NeuN、GFAP蛋白表达的影响 图2结果显示：与假手术组比较，肝切除组小鼠海马中NeuN蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），GFAP蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。与肝切除组比较，醒脾解郁汤低、中、高剂量组小鼠海马组织中NeuN蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），GFAP蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

3 讨论

醒脾解郁汤中的石菖蒲、西洋参、郁金和熟地黄是治疗认知障碍的常用中药，在治疗多种类型认知障碍疾病中具有较好的疗效[7，8]。本研究采用国内外认可的Morris水迷宫实验[9]评价醒脾解酒汤肝部分切除老年小鼠的空间学习能力以及记忆能力，结果表明，醒脾解郁汤干预能够显著缩短肝部分切除老年小鼠的逃逸潜伏期，增加穿台次数，提示醒脾解郁汤能有效改善肝部分切除术后小鼠的认知功能障碍。

POCD的具体发生机制尚未完全明确，但已有研究显示其发生可能与海马神经元凋亡密切相关。海马是中枢神经系统内与学习记忆能力等认知功能密切相关的重要部位，海马神经元凋亡增加是机体认知功能障碍的机制之一[10，11]。NeuN是神经元特异性标志物，是一种表达在神经系统大多数神经元胞核和胞浆中的特异性蛋白质[12]。GFAP是星形胶质细胞中最重要的骨架蛋白，其表达的强弱代表星形胶质细胞的功能状态，被认为是星形胶质细胞的特异性标记物[13]。星形胶质细胞参与组成细胞骨架，在大脑的神经发育中对神经元迁移具有引导作用，对神经元分化具有促进作用，可分泌多种生长因子和神经营养因子，对神经元具有支持和营养的作用，同时还可以通过调剂细胞内外离子平衡加强受损神经元的修复和再生，并对神经元的兴奋性具有调节作用。中枢神经系统损伤时，GFAP呈现上调趋势[14，15]。Bcl-2和Bax是细胞凋亡中的2个关键因子，它们分别是抑制和促进细胞凋亡的调控基因[16]。caspase 3被认为是各种凋亡刺激因子激活的caspase家族中的关键蛋白酶[17]。本研究结果显示不同剂量醒脾解郁汤可显著降低肝切除术后小鼠海马组织中Bax、caspase 3和GFAP蛋白表达水平，显著升高Bcl-2和NeuN蛋白表达水平，且呈剂量依赖性，表明醒脾解郁汤可减少肝切除老年小鼠海马中细胞凋亡以及增加海马中神经元。

图1 各组小鼠海马组织中Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白的表达Figure 1 Comparison of the expression levels of caspase 3，Bax and Bcl-2 proteins in mouse hippocampus of various groups

图2 各组小鼠海马组织中NeuN和GFAP蛋白的表达Figure 2 Comparison of the expression levels of NeuN and GFAP proteins in mouse hippocampus of various groups

综上所述，醒脾解郁汤可通过减少肝切除老年小鼠海马中细胞凋亡以及增加海马中神经元来减轻其术后导致的认知功能障碍。