模拟破坏苦杏仁和桃仁品质及酶活性变化研究

林史珍 ，杜方敏 ，林良静 ，高向阳 ，3△

（1.华南农业大学医院药剂科，广东 广州 510642； 2.华南农业大学食品学院·广东省功能食品活性物重点实验室，广东 广州 510642； 3.华农 ＜潮州 ＞食品研究院有限公司，广东 潮州 521000）

苦杏仁和桃仁皆是常用中药，始载于《神农本草经》，为蔷薇科植物山杏Prunus armeniacaL.var.ansu Maxim和植物山桃Prunus daridianaCarr.Franch的干燥成熟种子[1-2]，具有镇咳平喘、润肠通便、抗肿瘤和抗凝血等功效[3-6]。但因苦杏仁和桃仁是富油果仁，贮存过程中易走油，致使不饱和脂肪酸和苦杏仁苷含量减少，严重影响苦杏仁和桃仁的品质。早期采用经典恒温法、初匀速法等加速试验模拟中药变质规律[7-10]，但效果不理想。拱健婷[11]基于留样和加速试验结合感官、气味建立了相对有效的加速模型。阎敏等[3]利用正交设计法考察了贮存条件对苦杏仁质量的影响，并得出苦杏仁最佳贮存条件。颜永刚[12]对桃仁的品种、品质和药效之间进行了相关性分析，初步建立了评价桃仁质量的数学模型。张清安等[13]考察苦杏仁多酚氧化酶（PPO）粗提物的理化特性得出了苦杏仁中PPO最适温度为40℃。赵丽莹等[14]建立了苦杏仁中β-葡萄糖苷酶活性测定最优条件。杏仁中含有酚酸类物质和多酚氧化酶，在一定条件下会发生氧化褐变，从而影响杏仁的营养和经济价值[13]。本研究中探讨了苦杏仁和桃仁贮存过程中品质与酶活性变化的相互关系，现报道如下。

1. 材料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：FUSE 15A型种子老化箱（浙江托普仪器公司）；LC-15C型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV5100B型紫外分光光度计（上海元析仪器公司）；FA20048型电子天平（上海佑科仪器公司）；114摇摆式高速中药粉碎机（浙江瑞安永历制药公司）。

试药：苦杏仁苷对照品（大连美伦生物技术有限公司，纯度大于98%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；苦杏仁、桃仁（康美药业股份有限公司，批号分别为180601391，180402021），经广东药科大学中药标本馆主任刘基柱鉴定为正品。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁苷含量测定方法

溶液制备：取苦杏仁、桃仁样品适量，粉碎，过2号筛，分别称取苦杏仁粉末化各0.25 g置锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定质量，超声30 min，甲醇补足减失的质量，取滤液5 mL，加50%甲醇定容至25 mL，取滤液，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。取适量苦杏仁苷对照品，精密称定，加甲醇配制成质量浓度为300 mg／L的母液，即得对照品溶液。

色谱条件：色谱柱为Phenomenx-C18柱（250 mm×4.6nm，5μm）；A泵-水、B泵-乙腈，梯度洗脱（洗脱程序为0～8 min时10% ～26%B泵，8～15 min时 26% ～28%，15～18 min时28%）；检测波长207nm；柱温30℃；进样量 20 μL。

1.2.2 指标测定

油脂含量测定：参照2015年版《中国药典（一部）》（通则 0713）方法。

酸价测定：参照2015年版《中国药典（一部）》（通则2303）方法。

过氧化值测定：参照2015年版《中国药典（一部）》（通则 2303）方法。

多酚氧化酶活性测定：参考LS／T6124-2017。

β-葡萄糖苷酶活性测定[14]：称取苦杏仁和桃仁各 0.5 g，PVP 0.5 g，精密称定，加入适量 pH 5.0 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，冷冻离心，取上清液，得粗酶液。在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，加入粗酶液、50 mmol／L 硝基苯 -β -D-葡萄糖苷，于 pH 5.0、50℃反应30 min。加入1 mol／L碳酸钠溶液终止反应，在400 nm波长下测定吸光度值。酶活单位定义为该反应条件下，每g样品每分钟吸光度值变化0.001为1个β-葡萄糖苷酶活力单位，以U表示。

1.2.3 统计学处理

试验数据均取3次测定结果的平均值，并采用SPSS 22.0统计学软件处理。

2 结果

2.1 高温高湿加速破坏

苦杏仁、桃仁的油脂含量和氧化酸败程度：将苦杏仁、桃仁样品放置在35℃、相对湿度80%的高温高湿条件下，以样品出现微生物菌丝、呈现长菌状态停止取样，监测其油脂含量、酸价、过氧化值变化，详见图1 A至图1 C。样品在温度35℃、相对湿度80%条件下放置5 d时开始长菌，分别取放置1，3，4 d的苦杏仁和桃仁样品，以未处理样品为对照。在此高温高湿条件下，随着放置时间的延长，苦杏仁和桃仁中油脂含量不断降低，苦杏仁样品从59%降至47%，桃仁样品从59%降至37%；酸价和过氧化值则不断升高。这是因为温度越高，湿度越大，溶解在水中的氧气增多，油脂发生酸败的情况增大，导致油脂过氧化值上升，且湿度大，脂肪发生水解，脂肪酸含量上升，导致酸价上升。其中桃仁的油脂含量比苦杏仁下降得多，酸价整体也比苦杏仁高。说明桃仁较于苦杏仁“走油”现象和油脂氧化程度要明显。

图1 苦杏仁和桃仁指标测定结果

苦杏仁苷含量变化：苦杏仁苷含量是苦杏仁、桃仁品质的重要指标，故监测苦杏仁、桃仁在高温高湿条件下苦杏仁苷含量的变化，详见图1 D。可见，随着处理时间的延长，苦杏仁、桃仁的苦杏仁苷含量不断下降，前者苦杏仁苷从67 mg／g降至55 mg／g，后者苦杏仁苷含量从 58 mg／g降至 55 mg／g。

2.2 β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶的酶活力变化

由图1 E和图1 F可知，随着贮存时间的延长，苦杏仁、桃仁主要活性物质苦杏仁苷含量呈现下降趋势，随之而来的是发生霉变和褐变。因β-葡萄糖苷酶可以将苦杏仁苷分解成苯甲醛和氢氰酸等物质[15]，使其含量下降；多酚氧化酶为酶促褐变的主要酶源[16]。故监测与之相关的2种酶活性变化，可发现苦杏仁、桃仁品质变化与酶活性之间的联系。

在高温高湿条件下，随着放置时间的延长，苦杏仁、桃仁β-葡萄糖苷酶活性呈现上升趋势，前3d缓慢上升，4 d急剧上升，分别达 571 400 U／g和 472 131 U ／g，与图1 D结果相符；多酚氧化酶活性也是先升高后下降，放置3 d达到最高值，分别为1 623 U／g和1 491 U／g，随后有下降趋势。第4天，苦杏仁和桃仁样品开始出现白色菌丝，且2种酶的酶活性在第4天均出现了明显变化，可能与样品内部微生物活动有关。说明在高温高湿环境下β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶的活力均上升明显。苦杏仁、桃仁2个样品之间的2种酶变化趋势一致，无明显差异。

3 讨论

在高温高湿加速破坏条件下，随时间的延长，苦杏仁、桃仁所含油脂含量呈下降趋势，其酸价和过氧化值呈上升趋势，其功能活性物质苦杏仁苷含量分别下降了17.9%和5.2%；苦杏仁和桃仁中β-葡萄糖苷酶和多酚氧化酶活力均有明显上升趋势，其中β-葡萄糖苷酶在第4天酶活力分别达571 400 U／g和472 131 U／g；多酚氧化酶活性放置第3天分别达1623U／g和1491U／g。表明β-葡萄糖苷酶活性升高是使苦杏仁苷含量下降，以致其药效下降甚至丧失的主要原因；多酚氧化酶是导致苦杏仁和桃仁褐变的主要原因。2种酶活性的变化与在高温高湿条件下中药内部微生物活动有关。研究结果表明，在高温高湿条件下，苦杏仁和桃仁品质指标下降，与之相关的2种酶的活性明显上升，反映苦杏仁、桃仁在贮存过程中品质变化和酶活性的变化规律，根据测定酶活性判断苦杏仁、桃仁品质变化情况，为苦杏仁和桃仁在实际贮存过程中通过酶活性预测品质变化提供了参考依据。从控制酶的活性来保障苦杏仁、桃仁和其他富油果仁贮存品质，值得进一步研究。