重组人白介素35质粒的构建及鉴定

顾香 陈吉泉 李兵

【摘要】 目的：通过分子生物学技术构建重组人白介素35（IL-35）质粒，为进一步研究人IL-35的生物学功能奠定基础。方法：用KG-1细胞（人白血病细胞）扩增p35和EBI3的cDNA，将两者先后连接至pSectag2A质粒中，最后把Linker连接至pSectag2A-p35-EBI3中，构建成pSectag2A-IL-35质粒。结果：经测序等方法鉴定重组质粒中p35和EBI3序列与Genbank中（p35 NM-000882和EBI3 NM-005725）公布的序列一致。结论：成功构建pSectag2A-IL-35真核表达载体。

【关键词】 重组; PCR; IL-35; 质粒

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.078 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）17-0-03

【Abstract】 Objective：To construct recombinant human IL-35 expression vector by molecular biology technique，which could lay a foundation for further study of the biological function of IL-35.Method：EBI3 and p35 were amplified by PCR from the cDNA library derived from the KG-1 cells.And they were cloned into pSectag2A vector.Finally Linker was cloned into pSectag2A-EBI3-p35，and pSectag2A-IL-35 plasmid was successfully reconstructed.Result：The pSectag2A-IL-35 vector was verified by DNA sequencing，whose sequencing were consistent with those published in Genbank（EBI3 nm-005725，p35 nm-000882）.Conclusion：Psectag2a-IL-35 eukaryotic expression vector is successfully constructed.

【Key words】 Recombinant; PCR; IL-35; Plasmid

First-authors address：Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

IL-35是白介素12家族的一員，1997年Devergne等[1]报道了IL-35是由白介素12的p35亚基（IL-12 p35，即p35）和EB病毒诱导基因3（EBI3）构成。p35及EBI3基因编码分子量分别为35、34 kD的糖蛋白[2]。2007年Collison等[3]经小鼠体内实验初步证实，调节性T细胞（Treg细胞）可高表达EBI3和p35，且两者的二聚体能加强Tregs的免疫抑制功效。2007第13届免疫学国际会议上，由Vignali首次提议该二聚体命名为IL-35，最后成功获批。自此，IL-35就成为免疫学、分子生物学等领域研究的热点。本实验拟构建人IL-35质粒，为深入研究IL-35的生物学作用及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和质粒 人白血病细胞株KG-1由华东理工大学代同成博士惠赠，pSectag2A载体由英国格拉斯哥大学Wei Xiaoqing教授惠赠。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ，DL2000 Marker、T4DNA连接酶、质粒抽提试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）、T载体（TAKARA）、DNA胶回收试剂盒、RNA提取试剂。

1.1.3 培养基 DMEM高糖培养基购自GIBICO公司，Hyclone胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 p35和EBI3 cDNA的克隆 按照p35和EBI3在NCBI的GenBank中的cDNA序列，利用Primer Premier 5软件设计引物。依照pSectag2A质粒图谱，筛选酶切位点。在EBI3上游引物的5端加上4个保护碱基并引入HindⅢ酶切位点：AAAGAAGCTTTGCCCGCCCTGCAGTGGA，EBI3下游引物的5端加上5个保护碱基并引入EcoRⅠ及NotⅠ酶切位点：ATTAAGAATTCGCGGCCGCGCCCAGGCTCATTGTGG;在p35上游引物的5端加上10个保护碱基并引入NotⅠ酶切位点：ATATTAGAATGCGGCCGCAACCTCCCCGTGGCCAC，p35下游引物的5端加上4个保护碱基并引入XhoⅠ酶切位点：GGCCCTCGAGGGAAGCATTCAGATAGCTCAT;Linker引物均引入NotⅠ酶切位点，HLS：GGCCGCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGC，HLA：GGCCGCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCGC。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 KG-1细胞RNA的提取及PCR扩增目的片段 用PBS冲洗细胞2遍，按每106个细胞加入1 ml的Trizol，将细胞轻轻冲洗下来，收集至1.5 ml离心管中，随后加入200 μl氯仿，经过剧烈震荡，4 ℃，13 000 r/min离心15 min，可分3层，上层为RNA水相，将其吸出并加入500 μl异丙醇，冰上静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清，加入1 ml预冷的用DEPC水配制的75%乙醇，混匀后4 ℃，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入30 μl的焦碳酸二乙酯水溶解。

把上述RNA逆转录合成cDNA文库，逆转录-聚合酶链反应的反应体系：5×PrimeScript RT Master Mix 2 μl，Total RNA 7 μl，RNase Free 1 μl;反应参数：37 ℃ 30 min;85 ℃ 5 s，4 ℃ 10 min。

以上述引物为引物，将逆转录获得的cDNA为模板，扩增目的基因。PCR反应参数：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物EBI3、p35去掉信号肽序列、起始及终止密码子，大小为642 bp及591 bp。

1.2.3 IL-35-pSectag2A重组真核表达载体的构建 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察并照相回收目的片段。将胶回收的产物EBI3及p35连接到T载体上，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆于3 ml LB培养基中，37 ℃，120 r/min培养过夜。提取质粒，对EBI3利用HindⅢ、EcoRⅠ进行双酶切，用T4连接酶将酶切的目的片段和同样酶切的pSectag2A载体片段分别进行黏性末端的连接，转化培养，提取质粒，经PCR鉴定后测序。

测序正确后，将p35经NotⅠ、XhoⅠ双酶切，用T4连接酶将酶切的目的片段和同样酶切的pSectag2A-EBI3载体片段进行连接，转化培养，抽提质粒，经PCR鉴定后测序。

若测序正确，以退火反应获得Linker。退火体系：LinkerS：5 μl，LinkerA：5 μl，Buffer：10 μl，ddH2O：80 μl。退火参数：90 ℃ 5 min，37 ℃ 1 h。在退火产物中加入100 μl ddH2O，并加入600 μl无水乙醇，混匀后放入-20 ℃冰箱过夜，12 000 r/min，离心5 min，弃上清，待酒精挥发完后加入20 μl ddH2O，混匀后与经NotⅠ单酶切的pSectag2A-EBI3-p35载体连接，转化培养，抽提质粒，经PCR鉴定后测序。

2 结果

2.1 p35和EBI3基因的克隆

通过逆转录-聚合酶链反应扩增获得p35、EBI3基因片段，RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后可见大小约为591 bp及642 bp的条带，所获条带与预期大小相符（图1），可将其连接至pUCm-T载体。

2.2 pUCm-T-EBI3、pUCm-T-p35的酶切产物

RT-PCR产物EBI3与pUCm-T连接，同时与pSectag2A经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切;p35与pUCm-T连接，并与pSectag2A-BBI3经NotⅠ、XhoⅠ双酶切。上述酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。图2中1泳道为DL 2000 DNA Marker，2泳道显示大小两条带，其中小片段大小与预期大小相符（591 bp）;3泳道所显示条带的大小与预期大小相符（5 707 bp）;4泳道为10 000 bp DNA Marker，5泳道显示一条带，其大小与理论值（6 349 bp）一致，6泳道显示大小两条带，其中小片段大小与预期大小相符（642 bp），最后将目的片段p35和EBI3切胶回收，分别与pSectag2A及pSectag2A-EBI3连接。

退火获得Linker产物，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3。图3中2泳道显示一条带，大小与理论值（51 bp）相符，未见其他非特异性条带。

EBI3及p35片段先后连接至pSectag2A构成重组质粒pSectag2A-EBI3-p35，经过NotⅠ单酶切的产物，随后经1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。图3中4泳道显示的条带为线性化的pSectag2A-EBI3-p35载体，大小与理论值（6 349 bp）相符，切胶回收目的条带，最后与Linker连接。

2.3 重组IL-35-pSectag2A真核表达载体的鉴定。

以HES、HEA为引物PCR鉴定重组载体pSectag2A-EBI3，结果示图4中2、4、5泳道显示一条带，大小与理论值（642 bp）一致，表明pSectag2A与目的片段EBI3连接成功。用测序引物T7/BGH对pSectag2A质粒进行双向测序，测序结果与NCBI中GenBank上的序列（p35 NM-000882，EBI3 NM-005725）完全一致。

3 讨论

1997年，EBI3-p35由Devergne首次发现[1]，在2007年正式被命名为IL-35，后者是IL-12家族的一员，属于I型细胞因子超家族成员，由α链p35和β链EBI3组成[4-5]。IL-35主要由Treg、调节性B细胞（Breg）细胞分泌[3]。在Treg表面，IL-35的信号通路由信号传导及转录激活因（STAT）STAT1-STAT4，STAT4-STAT4，STAT1-STAT1介导[6];而在Breg表面，则由STAT1-STAT3介导[7]。

研究发现，IL-35是具有重要免疫调节功能的细胞因子[8]，通过增强Treg细胞的功能，抑制Th17细胞的增殖分化，发挥免疫抑制功能，抑制炎症反应、防止过度的自身免疫反应的发生[9]。由此可见，IL-35在诸多疾病中，均具有不容小觑的作用。本实验成功构建了pSectag2A-IL-35真核表达载体，为体内外进一步研究IL-35的功能和作用机制奠定了基础。

参考文献

[1] Devergne O，Birkenbach M，Kieff E.Epstein-Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（22）：12041-12046.

[2]石银月，武桂萍，颜学兵.IL-12细胞因子家族的新成员—IL-35[J/OL].中华实验和临床感染病杂志：电子版，2012，2（6）：159-161.

[3] Collison L W，Workman C J，Kuo T T，et al.The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function[J].Nature，2007，450（7169）：566-569.

[4]王志会.IL-35在免疫相关疾病中的研究进展[J].华中科技大学学报：医学版，2015，2（44）：239-242.

[5]黄崇标，田野，崔焱，等.白细胞介素35的在肿瘤发展中的作用[J].中国肺癌杂志，2016，19（4）：230-235.

[6]陈爽，鞠晓红，郑文彧，等.IL-35与人类疾病关系的研究进展[J].免疫学杂志，2014，7（30）：645-649.

[7]蒋瑜，张松照.细胞因子IL-35研究进展[J].国际检验医学杂志，2017，12（38）：1639-1641.

[8]姚國泰，陈励.IL-35与人类自身免疫性疾病的关系[J].细胞与分子免疫学杂志，2016，32（7）：993-999.

[9]韩丽，李培，武伏旭.IL-35在肿瘤中的研究进展[J].免疫学杂志，2018，10（34）：906-911.

（收稿日期：2019-01-08） （本文编辑：何玉勤）