食线虫性真菌F088分生孢子在不同渗透压下萌发率的探究

龚赛赛，魏佳欢，谭海川，黄艳宏，潘 立，蔡葵蒸*

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

现阶段世界各地对家畜胃肠道寄生线虫的防治几乎完全依赖于化学驱虫药，如阿维菌素、苯并咪唑、左旋咪唑等，随着驱虫药的不断使用，寄生虫抗药性不断增强，驱虫药的大量使用给自然环境造成了一定污染，而且会导致畜产品中有一定的化学药物残留，从而对人畜的健康产生威胁[1,2]。因此，很多科学家在抗寄生虫家畜品种的培育、草场管理系统、开发寄生线虫疫苗以及利用食线虫性真菌的生物防治等方面投入了大量精力。为了克服寄生虫抗药性逐渐增强，通过生物之间存在的拮抗作用防治这些动物疫病是非常具有可行性，而且利用食线虫性真菌对寄生性线虫进行生物防治不但技术难度小，还比较直接有效[3,4]。随着捕食线虫性真菌的出现，科学家们利用其与寄生线虫之间的拮抗作用，进而对家畜胃肠道的寄生性线虫进行捕杀，从而发现了食线虫性真菌巨大的潜在应用价值[5,6]。据统计，目前已发现有200多种真菌具有捕食线虫的能力，真菌可以利用其特殊的结构杀死自由生活线虫，而且其分布范围也特别广泛[7-10]。本研究的目的是利用西北民族大学蔡葵蒸教授课题组分离鉴定并提供的编号为 F088的食线虫性真菌为材料探究其孢子在不同渗透压下的萌发情况，以便为今后更好地利用这种捕食线虫性真菌进行动物寄生线虫病的防治及相关疫苗的研发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

食线虫性真菌Duddingtonia flagrans来自于西北民族大学生命科学与工程学院蔡葵蒸教授实验团队，选用的菌株的编号为F088。

1.2 制备培养基

1.2.1 2%麸皮液体培养基(WB) 1000 ml蒸馏水中加入新鲜麸皮20 g，微火煮沸1 h，补足沸腾过程丢失的水分待冷却后数层纱布过滤并于4℃冰箱过夜取上清液分瓶后121℃，20 min 高压灭菌备用。

1.2.2 2%水琼脂培养基（Water Agar，WA）1 000 ml凉开水中加入琼脂粉20 g，121℃高压灭菌20 min后倾注于玻璃培养皿中待凝固后，4℃冰箱保存备用。

1.2.3 玉米粉琼脂培养基 (CMA) 于1 000 ml蒸馏水中加入新鲜玉米粉40 g微火煮沸1 h，补足沸腾过程丢失的水分。数层纱布过滤并置于冰箱（4℃）沉淀12 h，取上清液并调节浓度至0.4 g/L，经121℃，20 min高压灭菌后倾注于培养皿中凝固后4℃冰箱保存备用。

1.2.4 马铃薯琼脂培养基（PDA） 新鲜土豆去皮切块后称取20 g，加入1 000 ml蒸馏水中微火煮沸1 h，补足沸腾过程丢失的水分，冷却后数层纱布过滤并于4℃冰箱过夜取上清液备用，分瓶后加入2%的琼脂粉，然后根据需要分别加入0%、5%、10%、20%的NaCl固体从而获得一个渗透压的梯度，最后经121℃，20 min 高压灭菌后，倾注于培养皿中凝固后4℃冰箱保存备用。

1.3 真菌的分离纯化

从4℃冰箱中取出保存有菌株编号为 F088的2%的玉米粉琼脂斜面培养基在无菌条件下使用接种针将适量的菌丝接种于2% WA琼脂平板培养基的中央位置，然后在25℃的条件下培养1周后挑取分生孢子至0.4%CMA琼脂平板培养基中连续纯化多次，直至获得食线虫性真菌F088的纯培养物。

1.4 真菌的培养

取出保存有捕食线虫性真菌F088纯培养物的CMA平板，然后在无菌条件下使用接种环或是接种针也可以是无菌的接种刀挑去适量菌丝或是大小合适的琼脂块接种到2%麸皮液体培养基中然后放置在摇床上在28℃和160 rmp的条件下培养8 d。8 d后再一次在无菌条件下使用移液管将适量的菌液接入到固体粮食培养基中在28℃的条件下培养21 d。

1.5 孢子的收集

在无菌条件下从粮食培养基中根据需要取出适量的粮食固体放置在一个三角瓶里。首先用长镊子将粮食尽量夹碎然后向三角瓶中加入配置并高压好的0.1%的吐温80直至瓶中的粮食固体完全浸没为止，然后在震荡仪上充分震荡让菌丝及孢子从粮食表面脱落，充分混匀后用一小烧杯取适量孢子洗脱液然后利用超声波使孢子和菌丝分离。将超声处理后的孢子洗脱液装入10 ml离心管中在离心机上以1 000 r/min离心5 min，此操作需重复3～5次，直到将残留的吐温洗净为止。离心完毕后用移液枪吸取20 ul孢子液在显微镜下计数孢子量并计算离心管中孢子的浓度然后根据需要将孢子浓度调节至合适的浓度（1 500个/ml左右为宜），最后将孢子放置在4℃冰箱保存备用（为保证孢子活性要尽快使用）。

1.6 孢子的涂布、培养及计数

用移液枪吸取300 ul孢子液注到制备好的不同渗透压的PDA平板上并用涂布棒涂匀，每个渗透压做3个平行编号为1、2、3、4（1号为对照组2、3、4渗透压依次升高）。然后使用封口膜将9个平板封口最后放置在28℃的培养箱中培养24 h后计数孢子的萌发率。计数孢子时可用刀或是打孔器切去大小合适的PDA琼脂块直接在显微镜下计数也可经棉兰染色液染色后再计数。

表1 食线虫真菌F088分生孢子不同渗透压下萌发率

2 结果与分析

由表1看出食线虫真菌F088分生孢子在PDA平板上在28℃的条件下培养24 h后其平均萌发率可达67.35%，同样的培养条件下在加了5% NaCl的PDA平板上的平均萌发率为3.65%，在加了10%NaCl的PDA平板上的平均萌发率为2.13%，在加了20%NaCl的PDA平板上的平均萌发率仅仅为1.10%，从这几组数据中可以看到随着培养基渗透压的不断升高孢子的萌发率是明显降低的。本次实验结果表明食线虫真菌F088其孢子的萌发率与培养基中渗透压的高低有关，在培养基中加了5%NaCl后它的萌发率有非常明显的降低，由对照组的67.365%下降为3.65%，并随着培养基中NaC含量的增加即培养基中渗透压的升高而继续降低，当培养基中的NaC含量增加至20%是孢子的萌发率仅为1.10%。

3 结语

胃肠道寄生线虫病是危害家畜健康成长的主要寄生虫病。随着寄生线虫对化学驱虫药抗药性的不断增强，寻找驱虫药的替代或补充方法已经显得尤为重要，而利用食线虫真菌对动物寄生虫的拮抗作用而控制这类动物疫病是目前最有前景的选项。当前已发表的研究成果中有对食线虫真菌生长及捕食环境的报道，比如对生长温度的要求、对pH的适应性、对培养基中的养分以及各种离子含量的需求。但是并未见对其孢子在不同渗透压下萌发情况的研究，本实验利用D. flagrans中编号为F088的菌株为研究材料对其分生孢子在不同渗透压下的生长状况做了一个简单的探究，对食线虫真菌的生长条件做了一个简单的补充，为以后菌株的分离纯化培养以及对优质菌株的选择提供简要参考。