帕立骨化醇和依那普利对ApoE基因缺陷小鼠的脂联素表达和心脏的保护作用

王洪浩 王慧智 田倩 杨森 方沛钰 代莉（通讯作者） 欧亚萍

（1 贵阳市第二人民医院心内科 贵州 贵阳 550004）

（2 贵阳市第二人民医院内分泌科 贵州 贵阳 550004）

帕立骨化醇是一种人工合成的具有生物活性的维生素D类似物，同维生素D一样帕立骨化醇需要通过与维生素D受体（VDR）结合才能发挥相应的生理效应[1]。临床研究显示，帕立骨化醇对心血管疾病、免疫炎症反应、肾脏疾病及肿瘤等都有一定的疗效。ACEI抑制剂依那普利属于肾素血管紧张素（RAS）系统，除了具有调节血压的作用，还能够改善因RAS活性升高引起的局部组织病理性损伤，Husain等[2]使用ApoE KO小鼠研究有关帕立骨化醇与依那普利联用对动脉粥样硬化小鼠损伤的药理作用，发现两药合用能够显著逆转小鼠主动脉炎性标志物COX2、TNF-α、MCP-1等的蛋白表达，研究结果说明帕立骨化醇与依那普利的联合应用不仅能改善ApoE KO小鼠主动脉的炎性损伤，还有效抑制了氧化损伤，并且使用疗效强于任何一种药物的单独作用。本文旨在通过动物实验，研究维生素D受体激活剂及血管紧张素转化酶抑制剂联用对ApoE KO小鼠体内及心脏组织脂联素表达、动脉粥样硬化相关因素及炎症因子水平的影响，是否能发挥抗动脉粥样硬化及心脏保护作用，探索一种新的治疗冠心病的治疗靶点，从而为临床治疗提供新的理论依据。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 ApoE KO小鼠，体重（25.0±1.8），由贵州大学动物实验中心提供并饲养，动物合格证号：SDXK（黔）2015-0003。饲养环境温度25°左右，湿度约50%，保证动物自由饮食和进水，同时昼夜循环光照。40只ApoE KO小鼠随机分为四组，使用帕立骨化醇及依那普利进行药物干预的实验治疗方式，检测维生素D受体激活剂及血管紧张素转化酶抑制剂这两种药物对ApoE KO小鼠脂联素表达、动脉粥样硬化相关因素及炎症因子的影响，探索一种新的治疗冠心病的治疗靶点。

1.1.2 实验仪器和方法 全自动生化分析仪（日立7170s），台式高速冷冻离心机（德国Hermle公司），PCR仪，电泳仪；帕立骨化醇购自雅培公司，依那普利购自扬子江药业。脂联素、COX-2、TNF-α试剂盒购自上海冠导生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将7周大的ApoE KO小鼠28只随机分为四组。给予如下16周的处理：组1：ApoE阴性对照组（n=6，腹腔内注射 100μl 丙二醇 每周3次）；组2：ApoE- 帕立骨化醇组（n=8，200ng 腹腔内注射 每周3次）；组3：ApoE-依那普利组(n=8，30mg/kg 腹腔内注射 每日一次)；组4：ApoE-帕立骨化醇+依那普利组（n=6帕立骨化醇200ng 腹腔内注射 每周3次+依那普利30mg/kg 腹腔内注射 每日一次)；通过动物实验，按分组饲养要求饲养动物，实验结束后分离心脏组织，采集血样样本利用生化、免疫组化及病理等方法，观察各组ApoE小鼠脂联素水平、动脉粥样硬化相关因素及炎症因子（如Tch、COX-2、TNF-a等）对心脏的表达差异。

1.2.2 标本采集 四组ApoE小鼠经过16周喂养处理后抽取左心室动脉血，并将小鼠血液在8℃条件下4000r/min离心15分钟，分离上层血清，-20°冰箱保存待测，采用全自动生化分析仪和PCR仪测定血清Tch、COX2、TNF-α值。

1.3 统计学分析

数据分析采用SPSS15.0软件包进行分析，符合正态性的计量资料用（±s）表示，两组以配对样本t检验，计数资料用百分率（%）表示，予以χ2检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2.结果

2.1 各组小鼠死亡情况

至实验结束前各组小鼠均未见死亡。

2.2 各组小鼠血清及心脏组织脂联素、Tch、COX-2、TNF-α水平表达对比

与对照组相比组2-组4脂联素水平均增高，具有统计学差异（P＜0.05），特别是组4脂联素水平明显增高，差异显著（P＜0.01）；组2-组4Tch水平均明显降低，具有统计学差异（P＜0.05）；组2-组4炎性标志物（COX-2、TNF-α）水平减低，具有统计学差异（P＜0.05），其中组4炎性标志物水平明显降低，差异显著（P＜0.01）。见表。

表 各组小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平对比（±s）

表 各组小鼠16周后血清Tch、COX-2、TNF-α水平对比（±s）

注：与给药前比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.01。

组别例数(n)脂联素（ug/ml）Tch（mmol/L）COX-2（mg/L）TNF-α（ug/L）组1612.59±3.465.74±1.335.34±0.658.41±0.24组2814.46±3.25*4.53±2.06*1.75±0.23*3.67±0.08*组3813.83±2.78*3.96±2.45*5.53±0.61*2.39±0.22*组4617.46±4.74*#3.54±1.27*1.28±0.14*#0.16±0.02*#P-0.0000.0000.0000.000

3.讨论

帕立骨化醇(paricalcitol)是由雅培公司(Abbott)研发的一种维生素D类似物，同维生素D一样需要通过结合VDR而发挥相应的生理效应，帕立骨化醇首先被用于预防和治疗继发性甲状旁腺功能亢进症(SHPT)。随着大量研究显示，帕立骨化醇除了对SHPT，对其它如心血管疾病、免疫炎症反应、肾脏疾病及肿瘤等都有一定的疗效。体内如果缺乏维生素D，就会增加心血管疾病的发病率，如高血压、缺血性心脏病和心力衰竭等，而帕立骨化醇能够抑制RAS系统活性，起到降压及有效改善左室重塑的作用。脂联素是目前发现的唯一具有保护性的脂肪因子，而氧化应激是动脉粥样硬化发生的重要机制之一，因此脂联素在保护心肌、延缓冠心病进展等方面发挥了重要作用。Kyriazi等[3]研究发现脂联素不仅可以终止 IL-6 和TNF -α介导的信号转导通路，还能诱发巨噬细胞中抗炎基因的表达，因此脂联素可通过复杂的抗炎作用来对抗动脉粥样硬化，从而起到保护血管内皮功能的作用。既往研究发现，当帕立骨化醇和依那普利联合使用时，不仅能显著增加ApoE KO小鼠体内脂联素的水平，还能有效预防大动脉内皮氧化损伤和炎症的发生。我们的研究结果发现VDRA联合ACEI治疗能够显著增高ApoE KO小鼠血清及心脏组织中脂联素水平，显著降低Tch和COX2、TNF-α水平，这也与既往国内外的研究结论相符合。本研究初步阐明了VDAR与依那普利联用，不仅能够改善ApoE KO小鼠动脉炎性损伤、抑制氧化损伤，还能保护心肌抑制左室重塑，从而起到抗动脉粥样硬化及心脏保护作用，为临床治疗提供了新的理论依据和治疗思路，但本研究样本量小，还需更多研究及临床实验加以证实。