外泌体中的miRNA-744-5P调控骨肉瘤细胞转移的体外实验研究

李耀玺 杨文杰 段莉 王大平（通讯作者）

（1 安徽医科大学深圳二院临床学院 安徽 合肥 230032）

（2 深圳市第二人民医院组织工程实验室 广东 深圳 100730）

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的恶性骨肿瘤[1]。骨肉瘤是一种遗传学上不稳定且高度恶性的骨间充质肿瘤，其可以产生类骨质基质和纤维间质[2]。本实验的研究意义在于：（1）构建4种骨肉瘤细胞的miRNA表达谱，寻找不同转移性骨肉瘤细胞外泌体中miRNA的表达差异。（2）利用外泌体中的miRNA为媒介，为探究骨肉瘤细胞的转移性提供新的依据（3）结合临床患者数据，探究外泌体中的miRNA成为一个预后因子的可能性。

1.资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 细胞系来源

骨肉瘤细胞株MG63(上海中国科学院细胞库)；

骨肉瘤细胞株Saos2(上海中国科学院细胞库)；

骨肉瘤细胞株U2OS(上海中国科学院细胞库)；

骨肉瘤细胞株HOS(上海中国科学院细胞库)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代 骨肉瘤细胞株Saos2、U2OS使用含有10%胎牛血清和双抗（1%的青霉素和链霉素）的McCoy’5A培养基，HOS、MG63使用含有含有10%胎牛血清和双抗（1%的青霉素和链霉素）的MEM培养基,培养条件均为：37℃，5%CO2,饱和湿度的环境中，2～3天更换新鲜培养基1次。实验所用均取处于对数生长期的细胞。

1.2.2 外泌体的收集 细胞上清中的外泌体收集主要通过梯度超速离心法。

1.2.3 转染实验 用于转染的miRNA-744-5P inhibitor序列5’-3’：UGCUGUUAGCCCUAGCCCCGCA

该产品购自苏州泓迅生物科技公司，miR-744-5P inhibitor是miRNA抑制物，本实验中即反义RNA寡聚物anti-miRNA，是化学修饰的成熟miRNA互补单链，产品为冻干粉形成的即用型试剂，使用前瞬时离心，用RNase-free H2O或灭菌dd H2O配制成20μM储存液，分装保存，避免反复冻融（应＜5次）。

20μM储存液的配制方法（1:50）

1.2.4 Transwell细胞迁移实验 选用购自美国corning公司的Transwell聚碳酯膜镶嵌套，每皿6孔，聚碳酯膜直径24mm，孔径8μm。选用高转移性的骨肉瘤细胞Saos2、U2OS进行miRNA-744-5P inhibitor的转染实验（如上述）。分别对比转染前后根据说明书进行细胞迁移实验。

2.结果

2.1 4种骨肉瘤细胞的形态学观察

4种骨肉瘤细胞贴壁生长，其中Saos2和MG63呈梭型,HOS与U20S呈类圆形。

2.2 高通量测序及实时定量PCR

高转移性骨肉瘤细胞与低转移性骨肉瘤细胞差异最明显的miRNA，实时定量结果，高转移组在细胞内和细胞外miRNA-744-5p 表达均高于低转移组。

2.3 Transwell实验结果

首先我们利用Transwell验证了Saos2、U2OS的高转移性，经过48小时的迁移后，Saos2、U2OS确实有大量的细胞突破了胶质层，迁移到了内室的下方，刮除内室残余细胞，经过结晶紫染色后，可见大量蓝紫色的细胞。

3.讨论

3.1 外泌体的收集方法

本研究首先针对4种骨肉瘤细胞的上清进行了大量的收集工作，再使用梯度超高速离心法获得4种骨肉瘤细胞的外泌体，将4种细胞内和细胞外的小分子RNA同时进行测序，本实验采用的是梯度超速离心法，梯度超速离心法是经典的提取外泌体的方法。具体操作步骤见实验记录，此方法耗时较长且成本较高，要求实验室配备超速离心机和较大的离心起始体积。

3.2 细胞迁移实验

Transwell实验是基于Transwell小室评估细胞迁移性的经典实验。我们选取美国corning公司的Transwell实验板，对4种骨肉瘤细胞进行了Transwell实验。在进行了miRNA-744转染实验后，高转移性的骨肉瘤细胞Saos2、U2OS表现了转染前明显的差异性，低转移性的骨肉瘤细胞HOS、MG63在转染前后未见明显异常。

4.结论

miRNA-744-5P在不同转移性的骨肉瘤细胞之间具有明显的表达差异，抑制骨肉瘤细胞中miRNA-744-5P的表达可以抑制骨肉瘤细胞的迁移能力。