五花茶配方优化对发热模型大鼠的疗效及其对肝肾的影响

甘柯林 李汉成 彭孝鹏

摘要 目的：觀察五花茶发热模型鼠的退热效应，进一步明确其退热机制，同时研究其对肝肾功能的影响。方法：将50只SPF级SD大鼠纳入研究，随机分为空白组、模型组及五花茶组。其中模型组及五花茶组利用对干酵母制备发热模型，随后五花茶组大鼠接受高、中、低剂量灌胃[剂量分别为6.480、3.240、1.620 g/（kg·d）]，空白组及模型组接受等体积生理盐水进行灌胃，各组均连续干预5 d，观察各组大鼠成模后不同时间点大鼠体温情况、干预前后大鼠肝肾功能的变化以及外周血清白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、环氧化酶1（COX-1）表达水平变化。结果：1）经过造模后大鼠体温明显升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05），且体温呈现出双峰热型，分别在术后2 h和5 h时出现，在研究过程中部分造模大鼠出现明显的精神萎靡、毛色暗沉，甚至出现寒战症状，这提示本此造模成功。与模型组比较，五花茶组大鼠体温明显下降（P<0.05），且各五花茶干预组之间退热效应差异无统计学意义（P>0.05）。2）与空白组比较，模型组与五花茶组ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），在五花茶干预组中，五花茶+黄芪组与五花茶+大枣组小肠推进率水平低于五花茶组，差异有统计学意义（P<0.05），五花茶+大枣+黄芪组小肠推进率低于其余2组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。3）与空白组比较，模型组及五花茶组大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明显升高（P<0.05），其中五花茶组上述指标的改变较模型组明显，其中五花茶+大枣+黄芪组改变幅度最大（P<0.05）。4）Western blotting实验显示：与空白组比较，模型组及五花茶组大鼠下丘脑组织COX-1明显下降升高（P<0.05），其中五花茶组COX-1浓度有所上调，各组间COX-1的OD值差异无统计学意义（P>0.05）。结论：五花茶有明显退热效应，具有一定的剂量依赖性，且无肝肾毒性，临床可推广应用。

关键词 发热;大鼠模型;五花茶;配方优化;肝功能;肾功能;IL-6;TNF-α;IL-1β;COX-1

Abstract Objective：To observe the antipyretic effect of Wuhua tea fever model rats，to further clarify its antipyretic mechanism，and to study its effect on liver and kidney function.Methods：A total of 50 SPF SD rats were randomly divided into blank group，model group and tea group.The febrile model was made by dry yeast in the model group and the Wuhua tea group，and then the rats in the Wuhua tea group were given high，middle and low doses [6.480 g/（kg·d），3.240 g/（mol·d）and 1.620 g/（mol·d）]，respectively.The blank group and the model group received the same volume of normal saline for gavage.Each group was treated with continuous intervention for 5 days.The body temperature，liver and kidney function，peripheral serum interleukin-6（IL-6），tumor necrosis factor-α（TNF-α），IL-1 β，TNF-α，TNF-β，TNF-α，TNF-β in peripheral serum were observed.The expression level of cyclooxygenase 1（COX-1）changed.Results：1）After modeling，the body temperature of the rats was significantly higher than that of the blank group（P<0.05），and the body temperature showed bimodal heat type，which appeared at 2 h and 5 h after operation，respectively.In the course of the study，some of the rats showed obvious mental malaise，dark hair color，and even shivering symptoms，which indicated that the model was successful.Compared with the model group，the body temperature of rats in the Wuhua tea group decreased significantly（P<0.05），and there was no significant difference in antipyretic effect among the intervention groups（P>0.05）.2）Compared with the blank group，there was no significant difference in ALT，AST，BUN and Cr between the model group and the five-flower tea group（P>0.05）.In the five-flower tea dry preparation group，the intestinal propulsive rate in the five-flower tea+astragalus membranaceus group and the five-flower tea+jujube group was lower than that in the five-flower tea group.The difference was statistically significant（P<0.05）.The intestinal propulsive rate of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was lower than that of the other two groups，the difference was statistically significant（P<0.05）.3）Compared with the blank group，IL-6，TNF-α and IL-1 β in the model group and the tea group were significantly increased（P<0.05），and the changes of the above indexes in the tea group were more obvious than those in the model group.The change range of Wuhua tea+jujube+astragalus membranaceus group was the largest（P<0.05）.4）Western blotting test showed that compared with the blank group，the COX-1 in the hypothalamus of the model group and the tea group decreased significantly（P<0.05），and the concentration of COX-1 in the group of the five flowers tea increased significantly（P<0.05），and the concentration of MDA in the hypothalamus of the model group and the tea group increased significantly（P<0.05）.There was no significant difference in OD value of COX-1 among the three groups（P>0.05）.Conclusion：Wuhua tea has obvious antipyretic effect in a dose-dependent manner and has no hepatorenal toxicity.it can be popularized and applied in clinic.

Key Words Fever;Rat model;Wuhua tea;Formula optimization;Liver function;Renal function;IL-6;TNF-α;IL-1 β;COX-1

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.08.016

发热是夏季风热感冒或流行性感冒的主要临床表现，五花茶是广东传统药茶，主要由金银花、菊花、鸡蛋花、木棉花、葛花、槐花、罗汉果组成，有清热解毒、解暑宣肺的作用[1]。有清热燥湿的苦寒类药物多耗气伤阴[2-3]，正如《血证论》云：“苦寒药能大伐生气”，我们在临床中亦发现五花茶在清热解暑的同时亦导致患者出现肠道或肝肾功能受损等毒性反应，且我们在前期筛选工作中发现五花茶中加入黄芪和大枣后即能保特原有作用又能减少苦寒性对肠胃、肝肾的影响，但其作用机制目前尚不明了。基于此我们以发热模型鼠为研究对象，利用五花茶加黄芪、大枣药液进行干预，以期观察其对肝肾毒性是否减少？配方优化是否影响五花茶的退热作用，具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 60只SPF级SD大鼠纳入研究，所有动物均购自南方医科大学[许可证号：SCXK（粤）2016-0041]。本研究最终符合实验要求的大鼠50只纳入研究，随机分为空白组10只，造模组40只。体质量（220±10.5）g，鼠龄（5±0.5）个月。所有动物均饲养于肇庆医学高等专科学校动物实验中心，饲养条件：温度（22.5±1.0）℃，湿度（53±0.5）%，以12/12 h为光暗周期。本研究方案经过肇庆医学高等专科学校伦理委员会批准进行。

1.1.2 药物 五花茶由本校中药研究院提供，中药组成：金银花10 g、菊花10 g、鸡蛋花10 g、木棉花10 g、葛花10 g、槐花10 g、罗汉果10 g;五花茶+黄芪组：基础方+黄芪15 g;五花茶+大枣组：基础方+大枣5枚。

1.1.3 试剂与仪器 BCA试剂盒（北京索宝生物科技有限公司，批号：28392739），干酵母悬液（合肥博美生物科技有限责任公司，批号：482732），IL-6试剂盒（上海广锐生物科技有限公司;批号：10923），TNF-α试剂盒（上海广锐生物科技有限公司，批号：11023），IL-1β试剂盒（购自上海广锐生物科技有限公司，批号：17293），环氧化酶1一抗抗体（美国CST公司，批号：4841S），欧姆龙MC-347电子体温计[欧姆龙自动化（中国）有限公司，貨号：PBA003149P]。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按照参考文献[4]中发热模型制备方法，具体操作如下：造模前3 d对大鼠早中晚3个时间点基础体温进行测量，将单次体温≥38 ℃且连续测量时体温波动≥0.5 ℃的大鼠剔除。本研究最终符合实验要求的大鼠有50只，随机分为空白组10只，造模组40只。其中40只造模组大鼠背部皮下注射10%干酵母悬液（10 mL/kg）。注射后每1 h测量1次体温，成模后（△T>0.8 ℃，约5 h）将大鼠随机分为模型组及五花茶组，其中五花茶组分为高、中、低剂量组。空白组与造模组大鼠在体质量、鼠龄等资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2.2 干预方法 五花茶组大鼠随机分为3组，分别是五花茶组、五花茶+黄芪组、五花茶+大枣组，按大鼠与人体间等效剂量换算将剂量组3.240 mL/（kg·d），灌胃1次/d，空白组及模型组大鼠接受等剂量的生理盐水灌胃，各组均连续灌胃7 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 各组大鼠成模后不同时间点大鼠体温情况 对各组大鼠进行灌胃，给药后，每1 h测量体温1次，连续测量6次，记录体温变化情况（△T=实测体温-基础体温），同时观察大鼠皮毛、精神状态、饮水摄食、二便、体质量等变化。

1.2.3.2 各组大鼠肝肾功能的变化 干预后每组随机选取5只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后取腹主动脉血，利用全自动生化分析仪对大鼠肝肾功能指标进行检测，肝功能：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST），肾功能：尿素（BUN）、肌酐（Cr）。

1.2.3.3 各组大鼠小肠推进率变化 干预后各组随机选取3只大鼠，禁食12 h后用活性炭进行灌胃，随后断头处死动物。剪取肠管计算小肠总长度，将幽门至活性炭前缘的长度作为肠管内推进距离，由此计算小肠推进率。

1.2.3.4 各组大鼠下丘脑环氧化酶1表达水平变化 干预结束后各组随机抓取3只大鼠，利用10%水合氯醛腹腔麻醉后冰上快速取出下丘脑组织，按照200 mg∶1 mL裂解液的比例加入适量1%PMSF的蛋白裂解液，匀浆后室温下静置10 min后，用BCA试剂盒测定样本总蛋白，根据结果得出上样量后进行电泳跑胶，转膜，加入环氧化酶1（COX-1）及β-actin一抗，比例均按照1∶1 000稀释，再进行生物辣根过氧化酶HRP标记的二抗孵育，最后显影、拍摄，用Image（BIO-RAD公司）的图像处理软件进行处理，测定各样本灰度值。

1.2.3.5 各组大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β浓度变化 收集1.2.3.2步骤中大鼠的腹主动脉血，4 ℃ 10 000 r/min下离心5 min，抽吸上清液，使用ELISA（酶联免疫吸附试验）对大鼠外周血清IL-6、TNF-α、IL-1β浓度进行检测，具体过程如下：将样本滴加如反应孔中，37 ℃孵育1 h，用PBS洗涤反应孔后每孔加入0.1 mL的酶标抗体，37 ℃孵育30 min，在用PBS洗涤，随后在各反应孔中加入0.1 mL的TMB底物溶液，37 ℃孵育30 min，再加入2 mol/L硫酸0.05 mL中止反应。随后将反应孔板置于酶标仪中读取数据，波长设置492 nm。操作过程全部按照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0对所得数据进行统计分析，计量数据如体温、肝肾功能、COX-1、IL-6、TNF-α、IL-1β均采用均数±标准差（±s）描述，符合正态分布的采用t检验，不符合正态分布的采用秩和检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体温变化情况比较 经过造模后大鼠体温明显升高，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05），且体温呈现出双峰热型，分别在术后2 h和5 h时出现，在研究过程中部分造模大鼠出现明显的精神萎靡、毛色暗沉，甚至出现寒战症状，这提示本此造模成功。与模型组比较，五花茶组大鼠体温明显下降（P<0.05），且各五花茶干预组之间退热效应差异无统计学意义（P>0.05）。见表1、图1。

2.2 各组肝肾功能及小肠推进率比较 与空白组比较，模型组与五花茶组ALT、AST、BUN、Cr差异无统计学意义（P>0.05），在五花茶干预组中，五花茶+黄芪组与五花茶+大枣组小肠推进率水平低于五花茶组，差异有统计学意义（P<0.05），五花茶+大枣+黄芪组小肠推进率低于其余2组小鼠，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组IL-6、TNF-α、IL-1β浓度比较 ELISA实验显示：与空白组比较，模型组及五花茶组大鼠IL-6、TNF-α及IL-1β均明显升高（P<0.05），其中五花茶组上述指标的改变较模型组明显，其中五花茶+大枣+黄芪组改变幅度最大（P<0.05）。见表3。

2.4 各组COX-1蛋白表达变化 Western blotting实验显示：与空白组比较，模型组及五花茶组大鼠下丘脑组织COX-1明显下降升高（P<0.05），其中五花茶组COX-1浓度有所上调，各组间COX-1的OD值差异无统计学意义（P>0.05）。见表4、图2。

3 讨论

发热是夏季风热感冒及流行性感冒常见的临床表征，多数与体内病变存在密切关注，换言之，发热是疾病转归的重要信号，值得临床重视。查阅大量文献[5-7]显示干酵母、LPS、2，4-二硝基酚等方法均可形成发热模型，本研究选用干酵母作为致热源进行发热模型制备，结果显示大鼠在短时间内出现了体温急剧升高，短时间内体温下降后又再次上升，故体温波动趋势形成2次热峰，这显示利用干酵母致发热模型具有稳定性、易于操作的优点。在研究中我们发现接受干酵母制备发热模型鼠机体IL-6、TNF-α及IL-1β水平出现明显升高，这与国内外诸多文献抑制，这进一步显示本研究造模成功。IL-6、TNF-α及IL-1β均是与炎性反应密切相关的因子，上述因子释放后刺激巨噬细胞介导机体的免疫调节环节，介导炎性反应效应，影响下丘脑体温调节中枢，从而出现发热[8-10]。本研究利用Western blotting检测各组大鼠下丘脑的COX-1水平变化，结果显示与空白组比较，模型组及五花茶组大鼠下丘脑组织COX-1明显下降升高（P<0.05），其中五花茶组COX-1浓度有所上调，各组间COX-1的OD值差异无统计学意义（P>0.05）。COX属于膜结合蛋白，是合成前列腺素和血栓素的关键蛋白，是花生四烯酸代谢途中的关键限速酶，广泛参与机体免疫调节、炎性反应等过程。其中COX-1是COX重要的异构体，是COX家族重要的抗炎因子，其浓度降低意味着机体抗炎效应减弱，故而出现发热[11-12]。本研究结果显示五花茶对发热模型鼠有明显退热效应，使用五花茶后大鼠外周血IL-6、TNF-α及IL-1β水平明显下降，COX-1表达上调，这揭示五花茶退热的主要机制与IL-6、TNF-α、IL-1β及COX-1有关。

我们认为外邪侵袭机体皮毛，借助孔道入里，营卫不和，正邪交织，故出现发热、热势退而复发，治疗应清热解毒、解表宣肺。五花茶由金银花、菊花、鸡蛋花、木棉花、葛花、槐花、罗汉果组成。方中金银花、菊花有清热解毒、疏风利咽之功。木棉花、葛花性均甘凉，均有清热利湿的作用，罗汉果花性凉，味甘，归肺、大肠经，主治清热润肺、止咳、利咽，诸药合用共奏清热解毒、解表宣肺的作用[13-14]。在临床实践中我们发现五花茶可明显改善夏季风热感冒及流行性感冒的症状，但与此同时我们亦发现由于五花茶性味多苦寒凉，苦寒凉易燥湿，也就是会损伤人体津液，部分脾胃虚寒、肠胃湿滞、体质较弱等人群服用后出现腹泻等症状，故我们在研究中加入黄芪、大枣，结果显示这两味药加入后对五花茶退热功效并未受影响，但大鼠的小肠推进率明显下降，这意味着加用黄芪大枣可明显减少五花茶的胃肠道反应，但大鼠的肝肾功能并未受损，故我们认为五花茶乃至加入黄芪、大枣后用于治疗夏季风热感冒及流行性感冒具有安全性。

采用五花茶治疗外感发热具有积极效应，加用黄芪、大枣对配方进行优化后既不影响药物的功效，又可减少未尝不良反应，具有一定的临床优势。

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（2019-04-09收稿 责任编辑：王明）