shRNA干扰URG11表达对骨肉瘤细胞恶性表型影响

孟涛 李玉霞 李卫华 潘华刚 张淞 王晓

[摘要] 目的 研究上調基因11（URG11）对骨肉瘤细胞（MG63）恶性表型的影响。

方法 用URG11短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒感染细胞，以实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）检测干扰效果。四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）测定细胞增殖，流式细胞术测定细胞凋亡，Transwell检测细胞侵袭和迁移，Western blot检测裂解的半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）和波形蛋白（Vimentin）等表达。

结果 URG11 shRNA重组慢病毒感染MG63细胞后，URG11表达下降，差异有显著性（F=181.200、97.307，P<0.001）;细胞存活率、侵袭和迁移数量降低，细胞凋亡率升高，E-cadherin、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高，Vimentin、MMP-9和MMP-2蛋白表达水平降低，差异均有显著性（F=28.064～625.516，P<0.05）。

结论 shRNA干扰URG11表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化，并诱导细胞凋亡。

[关键词] 骨肉瘤;上调基因11;肿瘤侵润;细胞运动;细胞凋亡

[中图分类号] R738.1

[文献标志码] A

[文章编号]  2096-5532（2019）06-0634-05

doi：10.11712/jms201906002

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

EFFECT OF SHRNA INTERFERENCE WITH EXPRESSION OF URG11 ON MALIGNANT PHENOTYPE OF OSTEOSARCOMA CELLS

MENG Tao， LI Yuxia， LI Weihua， PAN Huagang， ZHANG Song， WANG Xiao

（Department of Orthopaedics， Huaihe Hospital， He′nan University， Kaifeng 475001， China）

[ABSTRACT] Objective To study the effect of up-regulated gene 11 （URG11） on the malignant phenotype of osteosarcoma cells （MG63）.

Methods The cells were infected with URG11 short hairpin RNA （shRNA） recombinant lentivirus， and the interference effect was determined by real-time quantitative PCR （qRT-PCR） and Western blot. Cell proliferation was determined by MTT assay， cell apoptosis was determined by flow cytometry， and cell invasion and migration were determined by Transwell assay. Western blot was used to determine the expression of cleaved caspase-9， matrix metalloproteinase 2 （MMP-2）， E-cadherin， cleaved caspase-3， matrix metalloproteinase 9 （MMP-9）， and Vimentin.

Results After MG63 cell infection with URG11 shRNA recombinant lentivirus， URG11 expression was significantly reduced （F=181.200 and 97.307，P<0.001）. There were significant decreases in cell survival rate， number of cells with invasion and migration， and expression levels of Vimentin， MMP-9， and MMP-2 proteins， but there were significant increases in cell apoptosis rate and expression levels of E-cadherin， cleaved caspase-9， and cleaved caspase-3 proteins （F=28.064-625.516，P<0.05）.

Conclusion shRNA interference with URG11 expression can inhibit the proliferation， invasion， migration， and epithelial-mesenchymal transition of osteosarcoma cells and induce cell apoptosis.

[KEY WORDS] osteosarcoma; up-regulated gene 11; neoplasm invasiveness; cell movement; apoptosis

骨肉瘤是一种好发于青壮年和青少年的恶性骨肿瘤[1]，其恶性表型如增殖、凋亡、侵袭等与细胞内异常表达基因有关[2]。上调基因11（URG11）是近年来发现的参与细胞运动、增殖等过程的基因[3]，且在胃癌、肝癌等中发挥癌基因作用，下调URG11肿瘤生长和转移能力减弱[4-5]。URG11在骨肉瘤组织中呈阳性表达，且与肿瘤病人分期、转移相关，但其在骨肉瘤细胞中的作用尚不明确[6]。本实验通过干扰URG11的表达，探讨URG11对骨肉瘤细胞恶性表型的影响，为靶向URG11治疗骨肉瘤提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和试剂

骨肉瘤细胞MG63购自上海研谨生物科技有限公司;polybrene购自美国Sigma公司;SYBR定量PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;阴性对照慢病毒和URG11短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒由吉满生物科技（上海）有限公司构建;基质金属蛋白酶2（MMP-2）抗体、URG11抗体购自美国Abcam;裂解的半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved Caspase-3）抗体、基质金属蛋白酶9（MMP-9）抗体、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、

裂解的半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved Caspase-9）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology。

1.2 慢病毒感染

骨肉瘤细胞以每孔5×104个接种6孔板，于培养箱内培养，细胞融合度为40%时，以MOI=20分别添加慢病毒，再加入适量的polybrene（终浓度为5 mg/L）;培养12 h以后，加入新鲜培养液;培养72 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，以1 mg/L的嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞系。把不感染慢病毒的细胞设置为Control组（A组），把感染阴性对照慢病毒以及URG11 shRNA重组慢病毒的细胞分别设置为shRNA-NC（B组）、URG11 shRNA（C组）。

1.3 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定干扰效果

A、B、C组细胞提取总RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR。所用引物种类及其序列见表1。用SYBR定量PCR试剂盒分析URG11表达变化，计算方法为2-△△CT法，内参为β-actin。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.4 蛋白免疫印迹（Western blot）测定干扰效果

A、B、C组细胞分别用PBS洗涤2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法测定蛋白样品浓度，每孔30 μg蛋白样品，设置120 V的电压电泳2 h后，从玻璃板中間取出凝胶。将PVDF膜置于甲醇中孵育10 s以后进行转膜，转膜置于4 ℃条件进行。将PVDF膜置于新配置的含体积分数0.05牛血清蛋白溶液中，在室温结合2 h。把URG11一抗按1∶800倍稀释，PVDF膜置于一抗反应液中孵育过夜。再将二抗按1∶2 000倍稀释后，把PVDF膜置于二抗反应液内孵育2 h。使用ECL发光。采用Image J分析内参β-actin和目的条带URG11的灰度值，URG11蛋白水平=URG11的灰度值/β-actin的灰度值。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.5 四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞增殖

A、B、C组细胞培养24 h，添加20 μL的MTT溶液和180 μL细胞培养液至每个孔内培养4 h，再加入150 μL的二甲基亚砜，混合反应后，经空白孔调零。以酶标仪检测570 nm波长处的吸光度（A）值，把Control细胞的存活率设置为100%，分析其他各组细胞存活率变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

A、B、C组细胞中分别添加500 μL的Binding Buffer，混合后再添加PI和Annexin V-FITC染液孵育15 min，置于流式细胞仪中检测细胞凋亡变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.7 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移

A、B、C组细胞以不含血清的培养液悬浮，细胞密度调整为7×107/L，分别添加到Transwell小室的上室内进行迁移实验。每组添加200 μL细胞悬液，下室内添加500 μL的含血清培养液。24 h后，将小室取出，把没有穿膜的细胞擦掉并以PBS洗涤后，分别添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加甲紫染色后，在光镜下选取5个视野，计数细胞迁移数目。在侵袭实验前以基质胶将Transwell小室湿化，其余步骤同迁移实验。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.8 Western blot检测细胞中相关蛋白表达变化

A、B、C组细胞按照1.4中Western blot方法检测Cleaved Caspase-3、MMP-9、Cleaved Caspase-9、E-cadherin、MMP-2和Vimentin蛋白表达变化。每组实验重复3次，每次设3个复孔。

1.9 统计分析

采用SPSS 21.0软件分析实验数据，计量资料数据用±s表示，多组差异比较用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 URG11 shRNA下调对骨肉瘤细胞中URG11表达水平影响

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞中URG11 mRNA和蛋白表达水平明显下降，差异有显著性（F=181.200、97.307，P<0.001）。URG11 shRNA可下调骨肉瘤细胞中URG11表达和转录。见图1和表2。

2.2 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞存活率降低、凋亡率升高，差异有显著意义（F=28.897、625.516，P<0.05）。下调URG11可抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。见图2和表3。

2.3 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞侵袭和迁移影响

URG11 shRNA慢病毒感染后骨肉瘤细胞侵袭和迁移数目降低，差异有统计学意义（F=93.373、101.207，P<0.001）。下调URG11可抑制骨肉瘤细胞侵袭和迁移。见表4。

2.4 URG11 shRNA对骨肉瘤细胞中相关蛋白表达影响

URG11 shRNA慢病毒感染后，骨肉瘤细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表达水平升高，侵袭和迁移蛋白MMP-2、MMP-9表达水平降低，间质细胞标志物Vimentin蛋白表达水平下降，上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达水平升高，差异均具有统计学意义（F=28.064～148.737，P<0.01）。下调URG11则能够抑制骨肉瘤细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达，促进Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达，并且对细胞上皮间质转化（EMT）具有抑制作用。见图3和表5。

3 讨 论

URG11是被HBx蛋白上调的基因，与肿瘤的发生、发展和转移密切相关[7-8]。有报道显示，在胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等肿瘤中URG11高表达，下调URG11表达后肿瘤细胞生长、侵袭能力减弱，说明URG11可能在肿瘤中充当癌基因[4，9-11]。

研究显示，URG11高表达于骨肉瘤组织，且与骨肉瘤病人存活時间、转移等有关[6]。本文结果表明，下调URG11后的骨肉瘤细胞的增殖能力和侵袭迁移能力降低，细胞凋亡率升高，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞的恶性表型，其作用与之前在其他肿瘤中研究报道一致。

细胞凋亡受多种因素共同调控，其中Caspase蛋白家族是目前研究较为透彻的凋亡蛋白[12]。位于Caspase凋亡反应上游的蛋白成员如Caspase-9激活后可以促进凋亡反应的发生，而位于凋亡反应下游的Caspase-3激活后诱导细胞凋亡[13-14]。而且二者只有被激活后形成Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9才可发挥促细胞凋亡功能[15-16]。文献报道，虫草素可通过上调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表达诱导细胞凋亡，从而发挥抗骨肉瘤的作用[17];雷公藤红素也提高了骨肉瘤细胞HOS中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表达而使细胞凋亡[18]。本文结果显示，下调URG11表达后的骨肉瘤细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白表达水平升高，这说明下调URG11可能激活Caspase凋亡反应，这与细胞凋亡检测结果一致，进一步证实了下调URG11具有诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。

骨肉瘤具有较高的侵袭和转移性[19];而EMT与侵袭和迁移相关，且EMT的肿瘤细胞转移能力更强[20]。E-cadherin和Vimentin是细胞EMT的标志[21-23]。骨肉瘤组织中E-cadherin呈低表达，而Vimentin高表达[24]。研究也显示，沉默Vimentin能够抑制肝癌细胞的迁移和侵袭[25]。本实验结果显示，下调URG11后的骨肉瘤细胞中E-cadherin水平升高，Vimentin水平降低，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞EMT。

此外，基质金属蛋白酶也与细胞转移相关，其可通过降解细胞外基质促进细胞转移[26]。MMP-9和MMP-2是基质金属蛋白酶的成员[27-28]。FOXF1-AS1通过MMP-2/-9途径促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭[29];下调MMP-9表达可抑制人骨肉瘤细胞转移[30]。本文的实验结果显示，下调URG11后的骨肉瘤细胞中MMP-2和MMP-9表达水平均下降，说明下调URG11可以抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭，URG11具有抗骨肉瘤细胞转移潜能。

总之，本文结果证实了下调URG11具有抗骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移、EMT和诱导凋亡的作用，URG11表达可能是靶向治疗骨肉瘤的潜在靶点。本文结果为研究URG11在肿瘤中的作用提供了参考。本次实验研究没有在体内和多株骨肉瘤细胞中进行验证，后续会对上述部分内容及其具体的调控网络进行探索。

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