中药单体环黄芪醇的制备方法＊

楚治良，王好锋，韩 静，王晓娜，龚 慧，高春芳

黄芪甲苷（astragaloside IV）是中药黄芪发挥药理活性的主要成分。研究表明，黄芪甲苷具有很好的保肝［1］、降血糖［2］、抗肿瘤［3］等生物活性。黄芪甲苷虽然有很好的生物活性，但由于它相对分子质量和空间位阻较大，使其脂溶性和水溶性均较低，所以不利于机体的吸收和制剂的开发［4］。有报道称，黄芪甲苷在机体内可以经肠道菌群降解为环黄芪醇后被吸收利用［5］。环黄芪醇是黄芪甲苷的苷元，在自然界主要存在于黄芪中，属于环菠萝烷型四环三萜类化合物［6］（二者结构见图1）。由于相对分子质量较小，使其相对黄芪甲苷而言具有更好的脂溶性，更容易透过细胞膜而被机体吸收［7］。目前研究表明，环黄芪醇可以提高端粒酶活性从而提高CD3和CD8 T细胞的增殖能力来抑制细胞的衰老［8］，同时环黄芪醇展现出了它抗病毒的活性，因为T细胞增殖能力的加强，更有利于减少HIV病毒的产生［9］。

环黄芪醇在中药黄芪中含量很低，主要由黄芪甲苷制得。目前报道的方法主要有酶解法［10］、Smith降解法［11-13］、酸水解法［14，15］。 其中酶解法工艺简单，但对反应条件要求比较苛刻，并且酶的价格昂贵，不利于应用性推广。Smith降解法条件温和并且收率较高，但需要氧化→还原→水解→萃取→纯化五步完成［16］，步骤繁琐，成本较高。直接酸水解法操作简单，成本较低，但由于环黄芪醇在剧烈的酸性条件下极易转化为黄芪醇［13，17］（结构见图 1），所以在剧烈的条件下，直接采用酸水解法，收率较低。笔者以黄芪甲苷为原料，采用温和的双相酸水解法制得环黄芪醇，并利用正交试验设计法对有机相溶剂、反应时间、水溶液中甲醇和盐酸的体积分数4个因素进行优化，以获得条件温和、操作简单、成本低、收率较高的环黄芪醇制备方法，最终为环黄芪醇的进一步研究提供科学资料。

图 1 环黄芪醇（cycloastragenol）、黄芪甲苷（Astragaloside IV）和黄芪醇（Astragenol）

1 材料与方法

1.1 仪器与材料电子天平 （梅特勒托利多，AB-265-S）， 旋蒸仪 （德国 IKA 公司，RV10型），Waters E2695型高效液相 （Empower2色谱工作站,Waters 2424型蒸发光散射检测器），黄芪甲苷（南京春秋生物工程有限公司，批号：HQJG20170921，HPLC≥98%），环黄芪醇 （南京春秋生物工程有限公司，批号：HHQC20170921，HPLC≥98%），苯（麦克林生化科技有限公司，分析纯），三氯甲烷（上海化学试剂公司，分析纯），甲苯（成都市金山化工试剂厂，分析纯），甲醇（洛阳昊华化学试剂有限公司，分析纯），盐酸（开封市芳晶化学试剂有限公司，分析纯）。

1.2 试验方法

1.2.1原理 苷类化合物，在盐酸或硫酸的稀醇溶液中，可以水解生成苷元。如果苷元不稳定，直接酸水解法会使苷元产生异构化、脱水等反应，最终得不到真正的苷元。黄芪甲苷在剧烈的酸性条件最终主要产物是黄芪醇，而不是苷元环黄芪醇［13，17］。 因此采用双相酸水解法，一相为酸水相，一相为与酸水不互溶的有机相，根据苷元环黄芪醇易溶于亲脂性有机溶剂，而不易溶于水的性质，即在酸水解过程中，稀盐酸可将黄芪甲苷水解为环黄芪醇，游离出来的环黄芪醇随即溶于有机溶剂，使环黄芪醇不被酸水相破坏，从而提高反应收率。

1.2.2方法 包括：（1）双相酸水解法。准确称量100 mg的黄芪甲苷置于500 ml圆底烧瓶中，加入100 ml含一定浓度的盐酸和甲醇的水溶液，160 ml的有机相溶剂。在室温条件下剧烈搅拌一定时间后静置，收集有机相，取适量的碳酸氢钠水溶液中和酸水相，再加入等体积的三氯甲烷萃取。合并有机相，并用饱和氯化钠水溶液清洗两次，再用无水硫酸钠干燥有机相，减压浓缩，得白色固体。残留物用甲醇溶解并定容到10 ml，测定环黄芪醇并计算收率。其中，当笔者将100 mg的黄芪甲苷置于500 ml圆底烧瓶中，加入100 ml含有18%盐酸的20%甲醇水溶液（v/v），然后再加入三氯甲烷160 ml，在室温条件下剧烈搅拌6 d时，环黄芪醇收率最高为46.27%。（2）正交试验设计优化反应条件。在室温条件下，利用正交试验设计对双相酸水解的有机相（A）、甲醇浓度（B）、反应时间（C）和盐酸浓度（D） 4个因素进行优化。（3）色谱条件。色谱柱：XBridge C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（40∶60）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；漂移管温度：60 ℃；进样量：5～10 μl；氮气压力：25.0 psi；分析时间：16min。（4）标准曲线制备。精密称量环黄芪醇7.91 mg，加甲醇定容于10 ml容量瓶中，作为对照品溶液。 精密吸取对照溶液 3 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl依次注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样量的对数（X）为横坐标，以峰面积的对数（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。（5）供试品溶液的配制。精密称量浓缩后所得的环黄芪醇粗品10 mg，加甲醇定容于10 ml容量瓶中，即得。（6）收率计算。将双相酸水解法制备的样品用HPLC进行分析，依据标准曲线计算溶液中环黄芪醇的质量浓度，并计算收率（Z）。

2 结果

2.1 标准曲线环黄芪醇的线性回归方程为：Y=1.1043X+4.8684（r=0.9999）；环黄芪醇质量在 2.73～15.82 μg范围内线性关系良好。

2.2 双相酸水解条件的优化按照L9（34）正交表进行试验，试验结果显示（表1），试验中所考察的四个因素对环黄芪醇收率影响的大小顺序是A＞B＞C＞D，即有机相＞甲醇体积分数＞反应时间＞盐酸体积分数；最佳的反应条件为A1B3C3D3，即在室温条件下，有机相为三氯甲烷、甲醇体积分数为20%、盐酸体积分数为18%、反应时间为6 d时，环黄芪醇收率最高。根据正交试验方差分析显示（表2），与因素B和C进行对比，因素A具有显著的影响（P=0.041）。

表 1 双相酸水解法正交试验设计与结果

表 2 双相酸水解的正交试验方差分析

3 讨论

在传统的直接酸水解法制备环黄芪醇过程中，由于环黄芪醇在剧烈的酸性条件下极易转化为黄芪醇，所以直接采用酸水解法制备环黄芪醇目标产物收率较低。该试验采用双相酸水解法，避免了环黄芪醇在剧烈酸性条件下裂解为黄芪醇的不良反应，有效保护了环黄芪醇的稳定性，从而提高了收率。

该反应在室温条件下进行，条件温和，可以有效地以黄芪甲苷为原料制备环黄芪醇，反应无需加热、回流，工艺简单，有利于环黄芪醇的生产。

该试验利用正交试验设计法，对双相酸水解制备环黄芪醇的方法做了初步的研究，结果表明：有机相的种类对环黄芪醇的收率影响较大，最终确定在室温条件下，有机相为三氯甲烷、甲醇体积分数为20%、盐酸体积分数为18%、反应时间为6 d时，用黄芪甲苷制备环黄芪醇的效果最佳，但放大和工业化等方面仍需要进一步的研究。