下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液中的病原菌及耐药状况分析

郝芮，黄永坤，谭力，鲁萍，段晶

(1 昆明医科大学附属儿童医院，昆明 650228； 2 昆明医科大学第一附属医院，昆明 650032）

下呼吸道感染(Lower Respiratory Tract Infection, LRTI)是儿童的常见病、多发病，严重威胁小儿的健康，近年来随着抗菌药物的广泛使用，致病菌发生变异，细菌耐药日趋严重[1]，及时了解下呼吸道感染病原菌的分布情况及耐药现状，对临床有针对性的抗感染治疗及降低死亡率具有重要指导意义。电子支气管镜在临床上的推广，提高了病原学检查技术，支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)作为下呼吸道的病原检测标本更客观、准确。本研究对昆明医科大学附属儿童医院2017年1月-2017年12月BALF分离出的病原菌分布及其耐药状况进行分析总结，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年01月-2017年12月符合下呼吸道感染诊断标准[2]在昆明医科大学附属儿童医院住院行电子支气管镜检查，且送检支气管肺泡灌洗液培养阳性的68例患儿作为研究对象。排除标准：①严重通气和/或换气功能障碍，且未采用有效呼吸支持；②严重的心功能减退，心力衰竭及恶性心律失常；③严重凝血功能障碍，不能纠正的出血倾向；④有多发性肺大疱破裂风险；⑤严重消耗性疾病或状态[3]。

1.2 方法

1.2.1 标本采集

符合LRTI诊断标准、且有支气管镜检查及支气管肺泡灌洗术适应症[4]、无绝对禁忌症的患儿于入院后72h内采用奥林巴斯电子支气管镜进行检查，结合胸部影像资料选择主要的病变部位或者右肺中叶、左肺上叶舌段，用0.9%氯化钠注射液(37℃ 每次1mL／kg)注入相应肺段，共灌洗3次，立即用负压吸引器(100mmHg)将BALF回收至灭菌痰液收集器中，于30min内送检做病原菌培养及药敏试验。

1.2.2 提供质控菌株及来源

按照全国临床检验操作规程，将合格的标本接种于血平板、麦康凯平板和巧克力平板(35℃)后放置在5%～7%CO2孵箱培养18～24h，对平皿上可疑的致病菌进行涂片、革兰染色、显微镜下观察，革兰阳性菌进行触酶试验，革兰阴性者做氧化酶试验，可疑致病菌经分纯，采用法国生物梅里埃公司ATB半自动微生物分析做细菌鉴定，最后根据培养出的病原菌选择Kirby-Bauer法、Vitek系统等做药敏试验[5]，药敏试验以美国临床实验室标准化委员会(2016年CLSI)的标准进行判断。

1.2.3 统计学方法

应用SPSS18.0软件进行χ2检验，P＜0.05认为差异有统计学意义；细菌耐药性应用世界卫生组织耐药性监测组提供的软件WHONET 5.6进行分析。

2 结果

2.1 下呼吸道感染患儿病原菌的分布特点

295例送检支气管肺泡灌洗液进行培养的患儿中68例分离到单纯的致病菌，阳性率为23%；其中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，SP)36例(12.2%)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，HI)11例(3.7%)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)7例(2.4%)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis，MC)5例(1.7%)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae，Kpn)3例(1%)、大肠埃希菌(Escherichia coli，EC)3例(1%)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，Ab)2例(0.7%)、弗劳地枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii，CF)1例(0.3%)。68例阳性患儿中，男性44例(14.9%)、女性24例(8.1%)，经统计分析，男性患儿SP的分离率高于女性(χ2=5.783，P＜0.05)； 1～3岁患儿SP的分离率高于其他年龄分段(χ2=11.232，P＜0.05)，结果见表1。

表1 下呼吸道感染患儿病原菌的构成及其在性别、年龄上的分布

2.2 常见致病菌的耐药状况

药敏试验结果，肺炎链球菌对红霉素的耐药率高达97.2%，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率高达85.7%，两者对万古霉素均敏感；肺炎克雷伯菌对头孢呋辛、头孢曲松的耐药率分别为66.7%、33.3%，大肠埃希菌对头孢呋辛、头孢曲松的耐药率达66.7%，两者对亚胺培南的敏感性较高；流感嗜血杆菌对氨苄西林的耐药率达45.5%；卡他莫拉菌对氨苄西林的耐药率高达80%（详见表2）。

3 讨论

在20世纪70年代，儿童LRTI的致病菌以革兰阳性球菌感染为主，到80年代逐渐演变成以革兰阴性杆菌为主；近年来随着抗菌药物在临床上的滥用，病原谱及病原菌的耐药性不断发生变化，增加了治疗难度，因此对LRTI的病原学研究十分必要。既往研究[6]使用的痰标本合格率低，常存在高污染率及口咽部定植菌的影响。本研究通过支气管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage，BAL)可达远端的肺泡，采样范围广，且有效避免了上呼吸道杂菌的污染，能真实、客观的反映儿童下呼吸道感染的病原菌分布状况，提高了确诊率。

研究结果显示，下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液病原菌的分离率以SP(12.2%)、HI(3.7%)、SA(2.4%)排前三位。由于受到地理环境、经济条件、抗菌药物使用状况、微生态平衡及标本送检、采集等因素的影响，病原菌流行病学的研究存在很大的差异，胡萍等[7]对2013年-2016年在北京积水潭医院收治的2016例LRTI患儿进行痰培养或支气管分泌物培养，检出的病原菌中革兰阴性菌占92.9%，以鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌较为常见。SP被认为是呼吸道感染的首位病原菌，是健康人鼻咽部的常见寄生菌，只有在免疫力下降时才致病，多见于呼吸道病毒感染后的婴幼儿。本研究显示，SP在1～3岁(5.8%)、男性(8.1%)患儿的分离率较高。钟小珍等[8]对深圳市罗湖区人民医院收治的2639例LRTI患儿病原学分析得出，SP感染好发于年龄≤3岁的男性儿童，与本研究结果相一致。HI是一种无芽孢的革兰阴性杆菌，也是下呼吸道感染的重要病原菌。有研究表明[9]，因为SP疫苗的问世，导致HI逐渐成为儿童下呼吸道感染的首要致病菌。SA主要定植在人体皮肤表面，是儿童下呼吸道感染最常见的化脓性球菌之一，也是医院感染和社区下呼吸道感染的重要病原菌。

药敏结果显示，SP对红霉素的耐药性较高，耐药原因主要与ermB基因编码的核糖体靶位点的改变和主动外排机制有关。前瞻性酮内酯泰利霉素耐药菌追踪和流行病学(PROTEKT)的耐药监测数据显示，SP对大环内酯类药物的耐药率为35.8%，亚洲地区为59.3%、法国和西班牙分别为58.1%和57.1%、巴西为36.7%、欧洲为17.2%[10]。SA对青霉素有很高的耐药性，由于广谱抗菌药物的广泛使用，SA的耐药率逐年上升，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染已成为全世界难题，其总体分离率在日本为60%、欧洲南部国家34.3%、美国29%、中国21.5%、泰国19%[11]；其耐药机制是因外源性甲氧西林耐药决定因子A编码诱导低亲和力青霉素结合蛋白，从而对β-内酰胺类药物耐药。Kpn及EC对头孢呋辛、头孢曲松也存在耐药现象，其主要与产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的产生有关。ESBLs是丝氨酸蛋白酶的衍生物，对β-内酰胺类抗菌药物具有较强水解作用，能通过质粒介导在细菌间广泛传播，水解头孢菌素及单环β-内酰胺类药物而产生多重耐药。ESBLs的耐药菌株在全球范围内形势严峻，东欧地区39%～47%、中国香港29.5%、中国台湾23.4%、日本3.1%、北欧地区1%～5%[12]。既往氨苄西林曾作为治疗HI的首选药物，有良好的疗效，近年来研究[13]发现HI对氨苄西林和复方磺胺甲噁唑的耐药率呈上升趋势，其中韩国耐药率高达58%、中国台湾56%、美国42%、欧洲地区20%～40%；其耐药的原因有两方面：一是与产TEM-1和ROB-1β-内酰胺酶有关，另一机制是细菌细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白(PBPs)发生突变，导致抗菌药物与PBPs的亲和力降低[14]。近年MC耐药的研究[15]报道日益增加，主要原因是90%以上的MC都产β-内酰胺酶，这样的高产酶率导致对青霉素类抗生素普遍耐药，因此临床上推荐使用广谱青霉素类及其酶抑制剂的复合剂或对β-内酰胺酶稳定的第二代以上的头孢菌素类药物[16]。

表2 常见致病菌的耐药状况

综上所述，下呼吸道感染患儿支气管肺泡灌洗液病原菌以SP、HI及SA多见，病原菌的不断变化及耐药性日益升高，给临床治疗带来挑战。支气管肺泡灌洗液检查是下呼吸道感染治疗中不可或缺的重要手段，临床应注重支气管肺泡灌洗液细菌培养及药敏试验的开展，根据药敏结果针对性选择恰当的抗菌药物，控制多重耐药菌的产生。