CO2调控金针菇活性物质变化

甄彩云， 明 秋， 朱婷婷， 夏德宁， 蒋圣娟

(安徽科技学院 生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

金针菇(Flammulinavelutipes(Fr.) Sing)属伞菌目白蘑科金针菇属,因其菌柄细长,似金针菜,故而得名。金针菇是百姓餐桌上常见的食材,其干品中富含蛋白质,多糖类[1],多酚类等,具有抗菌、抗肿瘤、保护肝脏[2]、降血脂、提高神经系统认知[3]等功效,因此,金针菇药用价值高,市场需求量大。在金针菇的工厂优化栽培空间里,CO2浓度对金针菇的生长发育具有十分重要的作用。

大多数的食用菌不能耐受高CO2浓度,可是对于金针菇而言,高浓度的CO2可以抑制菌盖开伞,促进菌柄伸长,从而获得优质高产的金针菇。CO2是一种重要的维持大气平衡的气体分子[4],也是活细胞内重要的信号分子,高浓度的CO2将会引起生物体的异常生理反应,诱导基因的表达变化[5]。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)是生物体内广泛存在的一种酶,以磷酸吡哆醛作为辅助因子不可逆地催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)。GABA是天然存在的非蛋白质组成氨基酸,也是一种重要的生理代谢物,以信号分子的形式参与高等植物生长发育的生理过程[6],比如:植物的机械损伤,缺氧,干旱和抗寒胁迫等[7],且其代谢过程受到环境因子的严格调控。环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内含氮类激素的第二信使,由腺苷酸环化酶催化ATP环化而成,在动物,植物,真菌体内发挥着调控信号通路的作用[8-9]。这三物质作为信号分子在细胞的异常生理进程中发挥着十分重要的作用。另外,CO2与食用菌活性物质合成相关,引起物质含量(如蛋白质,糖类等)发生变化[10]。CO2对金针菇子实体生长发育的影响势必通过诱导或调控子实体内众多代谢和生理发育相关的物质含量的变化来实现。

本研究通过套袋的方法人为积累高浓度CO2,测定高浓度和正常培养条件下金针菇的GABA、GAD、cAMP的变化,同时测定基本代谢物如蛋白质,还原糖,多酚的含量变化。研究结果将丰富CO2调控金针菇生长发育的理论体系,并为工厂化生产实践提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

金针菇在安徽科技学院食用菌栽培基地种植培养。

1.2 仪器与试剂

756-MC型可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);Multiskan GO,全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific);YXQ-LS50S11立式压力蒸汽灭菌器(上海云泰仪器仪表有限公司);TGL-16G高速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);XHF-D高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)等。考马斯亮蓝G-250,3,5-二硝基水杨酸,没食子酸,碳酸钠等均为分析纯(国药集团化学有限公司)。GABA、cAMP、GAD酶联免疫分析试剂盒(上海心语生物科技有限公司)。

1.3 金针菇的培养与处理

将棉籽壳与麦麸按6∶1加水搅拌均匀,调节pH 6,装瓶,120 ℃灭菌90 min。冷却后,在超净工作台上接种,25 ℃培养。将长满菌丝体的培养瓶按出菇整齐度分为4组,每组20瓶,其中10瓶高CO2浓度下生长(套袋组),10瓶自然生长(不套袋组),每天喷洒水保持湿度。分别间隔3 d采样,分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。

1.4 样品制备

准确称取金针菇样品1 g于匀浆器中,加8 mL蒸馏水研磨成匀浆,冰上静置60 min充分提取,6 000 rpm离心20 min,上清液即为提取液。

1.5 蛋白质含量测定

以牛血清蛋白为标准品,考马斯亮蓝法测定。各试管中分别加入不同浓度的标准蛋白或待测液,然后每支试管中加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合后放置2 min,用分光光度计在595 nm波长下测定,绘制标准曲线并计算。

1.6 还原糖含量测定

以葡萄糖为标准品,3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。各管分别加入不同体积标准葡萄糖溶液或待测样本,DNS溶液,充分摇匀,在沸水浴中加热5 min,取出冷却至室温,分别用蒸馏水定容至20 mL,加塞后颠倒混匀,于分光光度计在540 nm测定。标准葡萄糖结果用于绘制标准曲线,计算样本中还原糖含量。

1.7 多酚含量测定

以没食子酸为标准品,福林酚法测定。各试管中分别不同浓度的没食子酸溶液或待测样本,加入福林酚试剂1 mL,5 min后,加入1 mL的7.5%的碳酸钠溶液并加蒸馏水定容至10 mL,摇匀,室温黑暗条件下静置90 min,以蒸馏水作为对照,在725 nm处测定吸光度。

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1.8 GABA、cAMP含量和GAD活性测定

应用双抗体夹心法测定GABA、cAMP含量和GAD活性。分别用纯化的GABA、cAMP和GAD抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入待测液,样本中含有的GABA、cAMP和GAD与辣根过氧化物酶标记的抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺显色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度。

1.9 数据处理与分析

数据处理使用Excel 2010,统计学分析采用SPSS 18.0软件。数据用平均值±标准差表示。*代表在0.05水平差异显著。

2 结果与分析

2.1 金针菇形态变化

通过套袋(高CO2浓度)和不套袋(正常CO2浓度)的方法,人为改变金针菇培养环境中CO2的浓度以考察CO2对其生长发育的影响。结果发现,套袋的金针菇(图1A)菌柄正常伸长,但是菌盖发育缓慢(图1C);不套袋的金针菇菌柄伸长正常(图1B),但是菌盖开伞较早,发育较快(图1D)。

2.2 蛋白质含量变化

蛋白质是组成一切细胞、组织的重要成分,与各种生命现象密切相关。通过测定,得到蛋白质的标准曲线为:y=0.003 3x-0.020 8,R2=0.991 1,说明数据可靠,可以用来计算样品蛋白质含量。如图2所示,高CO2浓度条件下,金针菇与自然条件下生长的金针菇相比,二者在生长过程的I期、IV期蛋白质含量相当,II期套袋的含量高,III期不套袋的含量稍高。

2.3 还原糖含量变化

还原糖是指具有还原性的糖类,含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离醛基的二糖都具有还原性。通过测定标准曲线得到方程为:y=0.715 2x-0.022,R2=0.992 9,说明数据可靠,可以用来计算样品还原糖含量。套袋种植的金针菇还原糖的含量在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅳ期与自然条件下的金针菇相差较小(图3),Ⅲ期套袋的还原糖含量比自然生长的高。

图2 不同时期蛋白质含量Fig.2 Contents of protein in different periods

图3 不同时期还原糖含量

2.4 多酚含量变化

多酚广泛存在于自然界,其抗氧化功能可以对氧化损伤导致许多疾病起到预防和治疗的作用。本实验测定的多酚标准曲线为:y=0.008 1x-0.002 8,R2=0.990 5,说明数据可靠,可以用来计算样品多酚含量。高浓度CO2条件下(图4),金针菇的多酚含量在Ⅱ期和Ⅲ期升高,Ⅰ期和Ⅳ期与自然条件下的几乎相同。

图4 不同时期多酚含量

2.5 GABA含量变化

图5 不同时期GABA含量

2.6 GAD活性变化

GAD酶的活性直接决定了GABA的含量。通过ELISA方法得到标准曲线为y=58.119x-0.014 9,R2=0.99,说明数据可靠,可以用来计算样品中GAD活力。套袋种植的金针菇在Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅳ期GAD活性与自然生长条件下的金针菇GAD活性相当,III期的活性比自然条件下高(图6)。

图6 不同时期GAD活性

2.7 cAMP含量变化

cAMP作为第二信使,可以激活下游很多条信号通路,引起机体的生理生化反应。根据ELISA法测定的标准曲线为:y=144.83x+0.060 5,R2=0.998 6,说明数据可靠,可以用来计算样品中cAMP含量。在金针菇生长的Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期,两种栽培条件下cAMP含量相差不大(图7);Ⅰ期时自然生长条件下的金针菇cAMP含量高于套袋处理组。

图7 不同时期cAMP活性

3 结论与讨论

金针菇肉质脆嫩，软润爽滑，味道鲜美，且富含蛋白质、糖和多酚类等营养物质，具有很高的食用和药用价值。《中华本草》中曾记载，金针菇性寒，具有补肝、益肠胃、抗癌的功效。现代医学药理学研究表明：金针菇能促进儿童智力发育，有“增智菇”美誉。它能防治成人高血压、胃溃疡和肝脏疾病，抵抗疲劳，并且还具有一定的抗癌功效。因此，金针菇是百姓餐桌上常见的药食同源的食用菌类食品，市场需求量很高。

栽培环境中，过高或过低的CO2浓度都会影响食用菌的生长发育，当空气中CO2浓度较高时，平菇、秀珍菇和猴头菇会发育成珊瑚状畸形菇；灵芝不形成菌盖，菌柄分化成鹿角状等。所以，适当浓度的CO2对食用菌的生长发育具有重要的调节作用。到目前为止，对于CO2调控食用菌子实体发育的机理研究主要有以下几点：(1)某些种类的食用菌可以利用CO2作为其在基质上定位子实体的信号[11-12]。靠近栽培基质的空气流动慢，局部CO2浓度较高，影响孢子散布，抑制菌盖扩展，促进菌柄伸长以寻找有利于子实体发育的低浓度CO2空间。(2)CO2与食用菌活性物质合成相关[10]。CO2激发子实体产生活性因子，调控其生长发育；CO2还引起子实体内某些物质含量发生变化。(3)CO2抑制呼吸作用，调节菌丝体内的贮藏化合物向结构化合物转化，从而影响子实体生长发育所需营养物质的正常供给，进而影响子实体的正常生长发育[13]。金针菇比较特殊，其主要食用部位是菌柄，所以菌柄的生物量取决于菌柄的伸长能力。在栽培过程中，发现：CO2浓度不同时，金针菇最为显著的特征是形态的差异，高CO2浓度促使其呈现出较长的菌柄和较小的菌盖形态。

通过测定金针菇的蛋白质、还原糖和多酚的含量，发现：在生长发育的Ⅰ-Ⅳ期，当CO2浓度较高时，蛋白质含量在Ⅰ期不变，Ⅱ期升高；还原糖含量在Ⅰ和Ⅱ期降低，Ⅲ期升高；多酚类物质Ⅰ期不变，而在Ⅱ和Ⅲ期升高。这说明，金针菇受到高浓度CO2调控后，糖类首先被消耗，使贮藏物质变成能量物质，为子实体基本生长发育提供能量和代谢中间产物；其次，蛋白质类开始合成导致含量慢慢增加，而多酚类含量增加可能与其抗氧化功能有关。

除了贮藏物质发生变化外，活性因子也对CO2浓度升高做出反应。GABA作为一类信号分子，其含量较低，却对高等植物发育过程(如植物的机械损伤，缺氧，干旱，耐盐和抗寒胁迫等)发挥重要的调节作用[14-15]。在番茄果实发育成熟过程中，GABA大量积累[16]，调节碳氮营养平衡。GABA通过信号转导途径促进烟草的花粉管的生长[17]。实验结果表明，高浓度CO2胁迫下，GABA的含量在I到III期均低于正常对照组，Ⅳ期含量与对照组相当。这说明该物质在初期被消耗，发育的后期含量上升。GAD是催化GABA合成的关键酶，参与植物的衰老，种子的发育与成熟及植物对外界胁迫的应激反应等过程[18]，其活性直接与GABA的含量有关。在Ⅰ和Ⅱ期，GAD活性低于对照组，Ⅲ期GAD活力上升，从而使Ⅳ期的GABA含量上升至对照组水平。这些结果说明，GAD的活性可以被高浓度CO2所抑制，原因可能是GAD催化生成GABA的同时，还生成CO2，CO2反馈抑制GAD的活性。低含量的GABA可能促进菌柄生产，抑制菌盖开伞有关。实验还发现，cAMP含量在两种栽培条件下，变化不大，可能在金针菇发育过程中cAMP的作用较小。

综上所述，在栽培过程中，高浓度CO2影响金针菇的蛋白质，糖类和多酚类的含量变化，而且最先响应的是糖类物质；GABA含量和GAD活性呈现出先抑后扬的模式，可能与菌柄伸长和菌盖延迟开伞有关；cAMP含量变化较小，可能对菌柄伸长的贡献较小。高浓度CO2调控GAD和GABA参与金针菇菌柄伸长的具体分子机制有待进一步研究。