蕨菜提取物抗肥胖作用及其机制

吴永祥 金友贞 权泰亨 毕淑峰 金泰完*

（1 黄山学院生命与环境科学学院 安徽黄山 245041

2 安东国立大学食品科学与生物技术学院 韩国安东 760-749）

肥胖是一种慢性疾病，同时也是Ⅱ型糖尿病、血脂异常症、心血管疾病、高血压和动脉粥样硬化等疾病发生的主要诱因，正成为本世纪全球健康最大的危险因素之一[1]。目前，市场上用于治疗肥胖的药物虽很多，但长期服用效果不理想，而且存在严重的副作用，比如头疼、呕吐、胃疼、腹泻等，因此人们急需一种安全并高效的治疗药物。研究表明许多中草药植物提取精华和植物中活性成分可作为膳食补充剂治疗肥胖[2-3]。

蕨菜（Pteridium aquilinum（L.）Kuhn var.Latiusculum（Desv）Underw），别名龙爪菜、龙头菜、如意菜等，属凤尾蕨科蕨属多年生不开花草本植物，在我国分布极为广泛。蕨菜富含多种对人体有益的营养成分，有“山珍之王”之称。蕨菜作为药食两用植物，有很高的药用价值，有清热解毒、消肿、利水、安神、润肠通便等功效[4]。目前研究证实蕨菜富含黄酮类、多酚类、多糖、萜类和甾体类等生物活性物质[5-8]，具有多种药理作用，包括抗氧化、抑菌、降血脂、抗炎症及增强机体免疫等[9-12]。然而，蕨菜对3T3-L1前脂肪细胞分化和高脂饮食诱导C57BL/6J肥胖小鼠是否存在调控作用尚无文献报道。为此，本研究拟通过建立3T3-L1脂肪细胞分化模型和高脂饮食诱导C57BL/6J肥胖小鼠模型，观察蕨菜提取物对脂肪细胞分化、小鼠体质量的抑制作用，评价其脂代谢和糖代谢状况，并从分子上初步阐明其作用机制，包括对脂肪细胞分化转录调控因子和脂质合成相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蕨菜，2016年5月于安徽省黄山市采集，品种经黄山学院生命与环境科学学院方建新老师鉴定。3T3-L1前脂肪细胞株，美国ATCC公司。C57BL/6J小鼠，4周龄健康雄性的C57BL/6J小鼠，Orient Bio，Inc.公司（首尔，韩国）。

噻唑蓝（MTT）、胰岛素、3 异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、油红 O、TG 测定试剂盒、TC测定试剂盒等，美国Sigma公司；DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、小牛血清及其它细胞培养试剂，美国Gibco公司；氧化物酶体增殖剂激活受体（PPARγ）、固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1c）、α-CCATT 增强子结合蛋白（CEBPα）、脂肪合成酶（FAS）、乙酰辅酶 A 羧化酶（ACC）、β-actin，美国 Cell Signaling Technology 公司；所有的荧光二抗，美国Jackson Immuno Research公司。

1.2 主要仪器

SpectraMax-190型全波长酶标仪，美国Molecular Devices公司；FA2004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；EV341型旋转蒸发仪，北京莱伯泰科仪器有限公司；CP-ST50A型CO2培养箱，长沙长锦科技有限公司；DL-CJ-1N型超净工作台，北京东联哈尔仪器制造有限公司；AllegraX-15R型冷冻离心机，美国Beckman公司；IX51型倒置显微镜，日本Olympus公司；电泳仪、半干转膜仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蕨菜乙醇提取物的制备 将蕨菜洗净晾干，60℃烘干至恒重，粉碎成粉末。取蕨菜粉末500.0 g，加入10倍体积分数为70%的乙醇振荡提取4 h，抽滤得乙醇提取液，滤渣以同样方法提取2次。合并3次滤液，减压浓缩后真空干燥成粉末，得蕨菜乙醇提取物（PAE）96.0 g，计算得提取效率19.2%。

1.3.2 3T3-L1前脂肪细胞的培养及诱导分化 3T3-L1前脂肪细胞用基础培养基（10%灭活胎牛血清、高糖DMEM、1%青链霉素混合液）在37℃、5%CO2且相对饱和湿度的培养箱中培养，每2 d换液1次，待细胞生长至80%时，传代培养。参考文献[13-14]，采用“鸡尾酒法”诱导3T3-L1前脂肪细胞分化：细胞以1×105个/mL接种于24孔板中，待细胞融合后接触抑制48 h，用诱导分化培养基Ⅰ（含 0.5 mmol/L IBMX，5 μg/mL 胰岛素，1 μmol/L DEX）诱导分化2 d，更换为含诱导分化培养基Ⅱ（含5 μg/mL胰岛素）培养2 d。以后每2 d更换1次基础培养基，直至90%的前脂肪细胞分化为脂肪细胞，并于第8天检测脂肪的含量。在细胞诱导分化过程中，加入低、中、高剂量的PAE，同时设立未诱导分化的细胞为对照组。

1.3.3 细胞的活性测定 细胞以1×105个/mL接种于96孔板中，待细胞贴壁培养2 d后弃培养基，加入含低、中、高剂量PAE的基础培养基，继续培养2 d。参考文献[15]，采用MTT法测定各组处理细胞在570 nm波长处吸光值AS。按式（1）计算细胞活性。

式中，AS——样品中在570 nm波长处吸光值；AC——未添加样品对照组在570 nm波长处吸光值。

1.3.4 细胞脂肪的油红O染色 参考文献[16]，在诱导分化的第8天，弃培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次晾干，每孔加入300 μL油红O染色静置1 h后弃染液，PBS清洗3次，倒置显微镜下拍照。随后每孔加入200 μL异丙醇，完全溶解细胞内脂滴结合的油红O燃料后，于520 nm波长处测定吸光值。

1.3.5 高脂饮食诱导C57BL/6J肥胖小鼠模型的建立 4周龄健康雄性C57BL/6J小鼠，适应性喂养1周后分为正常对照组（ND，n=10）和高脂组（n=20），其中正常对照组小鼠饲喂普通饲料（根据美国营养学会AIN-93标准制定），高脂组小鼠饲喂高脂高胆固醇饲料（添加20%猪油，0.5%胆固醇）。饲养6周，将高脂组小鼠体质量超过正常对照组20%以上作为高脂饮食诱导肥胖小鼠成模的标准[17]，其中体质量没有达到显著性差异的小鼠淘汰。

1.3.6 蕨菜提取物对肥胖小鼠的干预 造模成功后，正常对照组继续饲喂普通饲料，将高脂饮食诱导成功的肥胖小鼠分为2组，肥胖模型对照组（HFD，n=8）和PAE试验组（添加 1%蕨菜乙醇提取物，HFD+PAE，n=8）。持续饲养 8周，每 1周测定一次小鼠体质量，最后3周从尾静脉采血来测定小鼠血糖值。小鼠喂养条件标准，根据韩国食品研究院动物管理与使用委员会（Korea Food Research Institute Animal Care and Use Committee，KFRIIACUC，#2010-0011）的要求执行。

1.3.7 肝脏及脂肪组织H&E染色 取小鼠肝脏组织和附睾部位白色脂肪组织用4%多聚甲醛固定48 h后，常规脱水，石蜡包埋，制作切片，H&E染色，然后观察肝脏脂肪变性情况及附睾脂肪细胞的大小。

1.3.8 血清脂质测定 血液室温静置30 min后，7 000 r/min离心获得血清，按照试剂盒说明测定TC、TG的含量。

1.3.9 葡萄糖耐受测试 小鼠禁食过夜12 h，经口灌胃葡萄糖（1 g/kg体质量），尾静脉采血，分别测定空腹及糖负荷后30、60、90、120 min的血糖。

1.3.10 Western blot检测脂肪细胞相关蛋白质的表达 裂解3T3-L1脂肪细胞，提取细胞总蛋白，通过Bio-Rad蛋白试验进行蛋白定量。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE电泳，半干式转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭 3 h，接着用含有 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC、β-actin的一抗进行免疫印迹。用1∶5 000稀释的相对应二抗孵育1 h，PBST缓冲液洗清，暗房中滴加发光底物混合物于膜上，用X光曝光、显影及定影，即可显示目的条带。

2 结果与分析

2.1 PAE对3T3-L1细胞活性和分化的影响

由表1可知，不同质量浓度PAE（0.1，0.2，0.3，0.4 mg/mL）作用3T3-L1前脂肪细胞48 h后，细胞活性分别为100.58%，99.32%，98.63%，99.78%，与对照组相比，无统计学差异（P<0.05）。与未分化前脂肪细胞（Con）比较，分化成熟的3T3-L1脂肪细胞（MDI）油红O染色的OD值明显升高，是前脂肪细胞OD值的4.5倍，细胞内脂肪含量明显增加且具有显著性差异（表2，P<0.05），表明成功建立了3T3-L1脂肪细胞分化模型。添加PAE处理后，脂肪含量则明显下降。与空白对照组相比，PAE在质量浓度0.2，0.3，0.4 mg/mL处理条件下，其脂肪含量分别下降了14.92%，28.50%，43.98%。结果表明，PAE在0.1～0.4 mg/mL质量浓度内，对3T3-L1前脂肪细胞无毒性，而具有显著抑制脂肪细胞分化的作用，且随剂量增加而作用增强。

表1 PAE对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响Table1 Effect of PAE on cell viability of 3T3-L1 preadipocyte

表2 PAE对3T3-L1脂肪细胞分化的影响Table2 Effect of PAE on adipocyte differentiation of 3T3-L1cells

2.2 PAE对脂肪细胞 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC表达水平影响

Western blot结果显示，与未分化的前脂肪细胞比较，脂肪细胞 PPARγ、CEBPα、SREBP-1c、FAS、ACC表达水平均大幅度升高（图1与图2，P<0.05）。 0.2，0.3，0.4 mg/mL 质量浓度组的PAE均能显著抑制细胞分化转录调控因子PPARγ、CEBPα、SREBP-1c的蛋白表达；各组PPARγ表达抑制率分别为18.72%，90.83%，99.47%，CEBPα表达抑制率分别为90.29%，97.96%，97.81%，SREBP-1c表达抑制率分别为11.35%，37.46%，73.65%（图1，P<0.05）。同时PAE降低了脂质合成相关基因FAS、ACC的表达，随着质量浓度的增加，抑制作用增强（图2，P<0.05）。

图1 PAE对脂肪细胞PPARγ、CEBPα、SREBP-1c蛋白表达的影响Fig.1 Effect of PAE on the protein expression of PPARγ，CEBPα，SREBP-1c in adipocytes

图2 PAE对脂肪细胞FAS、ACC蛋白表达的影响Fig.2 Effect of PAE on the protein expression of FAS，ACC in adipocytes

2.3 PAE对高脂饮食诱导肥胖小鼠体质量、摄食量和食物利用率的影响

由图3可知，喂养6周后，HFD组小鼠的体质量与ND组相比，增加了20%以上，具有显著性差异（P＜0.05），说明高脂饮食诱导肥胖小鼠模型建立成功。从第2周开始，PAE显著降低高脂饮食引起的体质量增加，这一作用一直持续到第8周，且第5周后PAE组小鼠的体质量无显著性增长。由表3可知，PAE组摄食量与HFD组没有显著差异（P＞0.05），说明PAE并非通过抑制小鼠食欲来降低小鼠体质量增长的速率；PAE组小鼠的食物利用率显著性低于HFD组（P＜0.05），表明PAE是通过有效降低小鼠的食物利用率，从而起到抑制脂肪积累、抗肥胖的作用。

图3 PAE对高脂饮食诱导肥胖小鼠体质量变化的影响Fig.3 Effect of PAE on the body weight changes in mice fed a high fat diet

表3 PAE对肥胖小鼠体质量、摄食量和食物利用率的影响Table3 Effect of PAE on body weight，dietary intake，food utilization rate in obese mice

2.4 PAE对肥胖小鼠脂肪细胞大小和肝细胞脂肪变性的影响

通过对附睾脂肪组织进行H&E染色可知（图4），HFD组脂肪细胞在形态上明显膨大，而PAE组的脂肪细胞直径明显小于HFD组，同一视野条件下脂肪细胞数量增多，表明PAE降低了小鼠脂肪细胞的积累，抑制了脂肪细胞的分化，与PAE抑制3T3-L1细胞脂肪细胞分化的结果一致。与ND组相比，HFD组小鼠的肝脏组织中出现了巨大的脂滴空泡，发生了脂肪变性，而PAE组肝脏组织脂滴空泡明显减少，说明PAE具有抑制小鼠肝细胞脂肪变性和改善脂肪化肝细胞的作用（图5）。

图4 PAE对肥胖小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞大小的影响（100倍）Fig.4 Effect of PAE on the adpocyte size of epididymal adipose tissue in obese mice（x100）

图5 PAE对肥胖小鼠肝脏脂肪变性的影响（100倍）Fig.5 Effect of PAE on the fatty degeneration of liver in obese mice（x100）

2.5 PAE对肥胖小鼠血清中TC和TG的影响

由图6可知，与ND组比较，长期高脂饮食导致HFD组小鼠TG和TC含量均明显升高（P<0.05）；PAE干预后，血清中TG含量显著降低（P<0.05），然而对TC含量影响不大，说明PAE减轻了血清中TG的沉积，一定程度上改善了肥胖小鼠脂代谢异常。

图6 PAE对肥胖小鼠血清中TC和TG的影响Fig.6 Effect of PAE on the TC，TG levels of serum in obese mice

2.6 PAE对肥胖小鼠血糖和葡萄糖耐量的影响

由图7可知，与ND组比，HFD组血糖指数明显升高（P<0.05）。PAE组的血糖水平，低于HFD组，表现出显著差异（P<0.05），说明PAE能够有效控制小鼠血糖的上升，对高血糖有一定的治疗作用。在灌胃葡萄糖后30 min，血糖浓度达到峰值，120 min时血糖水平基本恢复正常，其中HFD组的血糖浓度明显高于ND组（P<0.05），表明高脂饮食导致葡萄糖耐量受损。经PAE干预后，各时间点的血糖水平均较HFD明显降低（P<0.05），有效改善了肥胖小鼠的糖耐量异常，见图8。

3 讨论

近些年，随着社会经济发展和人们生活方式的改变，全球肥胖率呈直线增长趋势，中国现已成为肥胖超级大国。肥胖不仅影响患者的生活质量与体型美观，更重要的是严重危害身体健康。医学研究表明，肥胖的病理过程包括脂肪细胞体积的增大、细胞数目的增多以及脂肪的积累，而这些主要归因于脂肪细胞的分化[18-19]。因此研究脂肪细胞分化的抑制作用及分子机制在肥胖代谢性疾病的防治上具有重要意义。

图7 PAE对肥胖小鼠血糖水平的影响Fig.7 Effect of PAE on the blood glucose levels in obese mice

本研究通过建立3T3-L1脂肪细胞分化模型和高脂饮食诱导C57BL/6J肥胖小鼠模型，观察蕨菜提取物对脂肪细胞分化、小鼠体质量的抑制作用。结果发现，蕨菜提取物可以显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，减少细胞中脂质的沉积。高脂饮食喂养的小鼠表现为体质量增加，脂肪细胞增大，肝细胞脂肪变性等。而给予PAE处理后，肥胖小鼠体质量显著降低，脂肪细胞增大、肝细胞脂肪变性均得到有效改善，表明PAE对肥胖具有治疗效果。通过对小鼠摄食量和食物利用率结果的分析，可知PAE并非通过抑制小鼠食欲来降低小鼠体质量增长的速率，而是降低了小鼠的食物利用率。PAE还可以降低肥胖小鼠血清中TG含量，然而对TC含量影响不大，说明PAE在一定程度上能够改善肥胖小鼠脂代谢异常。陈乃富等[10]的研究也观察到了类似的结果，表明蕨菜黄酮能够有效改善高血脂大鼠脂代谢紊乱，起到降血脂的作用。同时PAE能够控制小鼠血糖上升，修复葡萄糖耐量异常，对高脂饮食引起的高血糖有一定的治疗作用，从而改善糖代谢紊乱。

为阐明其中的分子机制，本研究检测了脂肪细胞分化过程中细胞分化转录调控因子和脂质合成相关基因的表达水平。PPARγ和CEBPα是脂肪细胞分化最重要的两个细胞转录调控因子[20]。PPARγ和CEBPα能诱导脂肪细胞分化，促进下游脂肪特定基因表达，包括脂联素、抵抗素和载脂蛋E，并能够调节血脂代谢[21-22]。SREBP-1c也被认为是脂肪细胞分化的关键转录因子，能够在细胞分化过程中增加PPARγ的活性[23]。“鸡尾酒法”诱导了脂肪细胞分化转录调控因子PPARγ、CEBPα、SREBP-1c的高表达，而PAE降低了PPARγ、CEBPα、SREBP-1c活性，从而抑制了脂肪细胞分化。FAS和ACC在脂质合成和分解代谢中发挥着重要作用[24]。PAE则降低脂质合成相关基因FAS、ACC的表达，减少了脂质合成。

图8 PAE对肥胖小鼠葡萄糖耐量的影响Fig.8 Effect of PAE on the blood glucose tolerance in obese mice

综上所述，蕨菜乙醇提取物能够有效抑制3T3-L1脂肪细胞分化，改善肥胖小鼠体质量，消除高血脂和高血糖异常，修复葡萄糖耐量，这一作用可能与其调控脂肪细胞分化转录调控因子和脂质合成相关基因等密切相关。