蛋清源抗氧化肽对HEK293细胞氧化应激损伤的抑制作用及机制

张 燕 陈志飞 赵颂宁 张 婷 刘静波

（吉林大学食品科学与工程学院 长春 130062）

氧化应激（Oxidative stress，OS）为活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）的产生和抗氧化防御系统之间的失衡[1-2]。机体处于OS状态时，会对细胞内大分子产生氧化损伤，进而导致细胞功能退化、衰老和凋亡，并对机体造成不可逆损害。氧化应激和机体衰老密切相关，并且参与动脉粥样硬化和神经退行性疾病的病理过程。无论从营养学角度还是临床医学角度来看，氧化应激对人体健康的影响已不可忽视，目前相关的研究已经引起科研工作者的广泛关注。

随着经济发展，人们知识水平和生活水平的不断提高，人工合成抗氧化剂的安全性受到广泛质疑，由此引发人们对天然、安全来源的抗氧化剂研究的极大关注[3-4]。生物活性肽（Bioactive peptides）具有比氨基酸和蛋白质更强的生物活性和多样性，更易吸收并且安全可靠，已成为国内外科技工作者的研究热点和重点[5-7]。禽蛋蛋白质含量丰富，且其氨基酸组成与人类必需氨基酸比例接近，是获取生物活性肽的良好资源。近来有研究表明，蛋清源肽具有一系列的生物活性，如抗氧化，抗高血压，抗糖尿病，抑制氧化应激和抑制血管紧张素转化酶活性等[8-13]。

本文从细胞及蛋白水平研究了蛋清源抗氧化肽对过氧化氢诱导的HEK293细胞氧化应激的抑制作用及其机制，为预防氧化应激可能对人体造成的伤害提供新的预防思路，为蛋品在食品深加工、制药和化妆品等方面的应用提供理论基础，并有助于人们深入了解机体氧化应激状态的机制，为增加蛋品附加值，提高蛋品利润空间提供一些思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛋清源肽（＞95%），上海强耀生物科技有限公司；人胚肾细胞（HEK293），中国科学院细胞库。

Trolox（分析纯）、二苯代苦味肼基（DPPH，分析纯）、ABTS（分析纯）、荧光素钠（Fluorescein sodium，分析纯）、AAPH（分析纯），美国 Sigma 公司；戊二醛固定液（2.5%）、圆形玻璃盖玻片，上海釜诚生物科技有限公司；细胞丙二醛（MDA）测试盒、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测试盒、总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测试盒、总蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所；DMEM培养基，美国GIBCO公司；过氧化氢（分析纯），天津化学有限公司；MTS单细胞溶液增殖检测试剂盒，美国Promega公司；BCA蛋白定量分析试剂盒，鼎国生物有限公司；SOD抗体、β-actin抗体、GPx1抗体，英国Abcam生物公司；过硫酸钾、甲醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，北京化工厂。

8条蛋清源五肽的序列简写分别为QGYIF（Gln-Gly-Tyr-Ile-Phe）、WNWAD（Trp-Asn-Trp-Ala-Asp）、FWIHI（Phe-Trp-Ile-His-Ile）、WLKFI（Trp-Leu-Lys-Phe-Ile）、RIFQW（Arg-Ile-Phe-Gln-Trp）、CFDVF（Cys-Phe-Asp-Val-Phe）、EWTSS（Glu-Trp-Thr-Ser-Ser）和VYQFL（Val-Tyr-Gln-Phe-Leu）。

1.2 仪器与设备

电子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；黑色孔板（透明平底），德国Greiner Bio-One公司；移液器，德国Eppendorf公司；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱，上海力申科学仪器有限公司；低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；倒置生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司；雪花制冰机FM130，北京长流科学仪器有限公司；基础电源、垂直电泳槽、转膜仪，美国Bio-Rad公司；c300凝胶成像系统，美国Azure公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋清肽DPPH自由基清除活性测定 DPPH自由基清除活性按照文献[12]报道的方法，具体操作如下：用80%甲醇配制浓度为150 μmol/L的DPPH溶液，在96孔板的每孔中加200 μL DPPH溶液，每孔加样品50 μL。室温避光反应30 min后，用酶标仪（Microplate reader）在520 nm波长处测定OD值。DPPH溶液现用现配。

试验分为3 组：（1）空白组：200 μL 甲醇溶液加 50 μL 蒸馏水；（2）对照组：200 μL DPPH 溶液加 50 μL 蒸馏水；（3）试验组：200 μL DPPH 溶液加样品 50 μL（终浓度 1，10，100，1 000 μmol/L）。每个样品浓度设置3个复孔，取平均值。DPPH自由基清除率按公式（1）计算。

式中，ADPPH——DPPH溶液在517 nm波长处的吸光度；As——包含样品和DPPH溶液的吸光度。

以Trolox溶液作为标准参照物，设置系列浓度梯度的Trolox 溶液（10，50，100，200，400 μmol/L）与DPPH溶液反应。以Trolox浓度值为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线。一定浓度的样品溶液，测定其DPPH清除率后，根据标准曲线计算Trolox当量，确定其相对抗氧化活性，结果表示为Trolox抗氧化当量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC Value），此处定义其单位为μmol/L TE/1 000 μmol/L，即样品浓度为1 000 μmol/L时自由基清除能力相当于多少μmol/L的Trolox自由基清除能力。同一浓度的不同样品，如果其TEAC值越大，说明其清除DPPH自由基的能力越强。

1.3.2 蛋清源活性肽对ABTS自由基清除活性测定 ABTS与过氧化物酶和氢过氧化物在一起形成ABTS+阳离子自由基。在抗氧化剂存在时，这种自由基混合物的光吸收值下降，下降程度取决于抗氧化剂的抗氧化能力。ABTS自由基清除活性按照实验室已建立的方法进行测定[14]，略有修改。取1片（10 mg）ABTS于蒸馏水中配制成7 mmol/L的ABTS溶液，与过硫酸钾溶液（终浓度为2.45 mmol/L）按1∶1的体积比混合即得ABTS储备液，使用前需在室温条件下避光12～16 h。测定前用磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline，PBS）稀释ABTS储备液至吸光度为（0.7±0.02）左右，为ABTS工作液，现配现用。试验分为3组，每个样品浓度3个复孔，空白组：每孔加200 μL PBS溶液；对照组：每孔 180 μL ABTS 工作液+20 μL PBS；试验组：每孔 180 μL ABTS 工作液+20 μL 肽溶液（终浓度分别为1，5，10，15，20，25，30，35，40 μmol/L）。以Trolox溶液作为标准参照物，设置系列浓度梯度的Trolox 溶液（10，20，50，100 μmol/L）与ABTS工作液反应，以Trolox浓度值为横坐标，ABTS清除率为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算Trolox抗氧化当量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC值），即被测抗氧化剂清除ABTS的能力（吸光度大小的变化）与标准抗氧化剂trolox（VE的水溶性类似物）清除ABTS的能力的比值，从而确定各条肽的相对抗氧化活性。按公式（2）计算。

式中，A1——试验组的吸光度；A2——对照组的吸光度；A3——空白组的吸光度。

1.3.3 蛋清肽氧化自由基吸收能力（ORAC）测定 ORAC试验参考Lin等[14]的方法并略作修改。反应在 75 mmol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）溶液中进行。吸取20 μL样品溶液和120 μL荧光素钠溶液（终浓度为70 nmol/L）至黑色96孔板各孔中混合反应，在37℃下预热2 min，然后用多道移液器快速加入 60 μL AAPH溶液（终浓度为12 mmol/L）启动反应，并将黑色96孔板立即放入酶标仪中，在37℃下检测记录。相邻两个测定点之间的时间间隔设置为2 min，每次读数前振板2 s，连续测定180 min（荧光衰减趋于稳定为止）。设置酶标仪的激发波长为485 nm，发射波长为520 nm。

试验中8条五肽的终浓度均为10 μmol/L，每个样品设置3个复孔。空白组为120 μL荧光素钠溶液加20 μL PBS溶液。AAPH自由基作用下的荧光衰退曲线下面积按公式（3）计算。

式中，f0——初始0 min时的荧光相对强度；fi——第i个测定点时的相对荧光强度。

样品的抗氧化能力与AAPH自由基作用下荧光衰退曲线的延缓部分面积（Net AUC）直接相关。样品作用下的荧光衰退曲线下面积与空白组的荧光衰退曲线下面积之差，即荧光熄灭曲线的延迟部分面积Net AUC为样品的保护面积，按公式（4）计算。

Trolox是维生素E的水溶性类似物，是一种常用的抗氧化剂和自由基清除剂。在ORAC法中Trolox溶液可作为阳性对照物和标准溶液。抗氧化剂的氧自由基清除能力ORAC值，又称为抗氧化剂的抗氧化能力指数，是通过荧光衰退曲线的保护面积与标准抗氧化物质Trolox的保护面积相比得出。ORAC值以Trolox当量（Trolox equivalent，TE）来表示，单位为μmol/L TE/μmol/L，按公式（5）计算。

1.3.4 蛋清肽对HEK293细胞的毒性作用 HEK 293细胞培养方法参考陈志飞等[8]的方法。完全培养液由DMEM培养基、胎牛血清、双抗和非必需氨基酸溶液以90∶10∶1∶1的体积比配制而成。将密度为5.0×104cells/mL的HEK293细胞接种于96孔板各孔中，每孔接种90 μL，试验设置空白组（100 μL 培养基）、对照组（90 μL 细胞混悬液+10 μL 培养基）和试验组（90 μL 细胞混悬液），培养24 h。然后在试验组中加入10 μL终浓度为1，10，20 μmol/L的蛋清五肽溶液（每个浓度设置6个复孔），在37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h后，细胞存活率的检测采用单溶液细胞增殖检测试剂盒（CellTiter 96RAQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit），即 MTS 法[8]测定。

1.3.5 蛋清源活性肽对H2O2氧化损伤的HEK293细胞的保护作用 将密度为6.0×104cells/mL的HEK293细胞接种于96孔板中，每孔接种80 μL。 设置空白组（100 μL 培养基）、对照组（80 μL细胞混悬液+20 μL 培养基）、损伤组（80 μL 细胞混悬液）和保护组（80 μL细胞混悬液），每个试验浓度设置6个复孔。损伤组细胞的处理采用已建立的过氧化氢诱导的HEK293细胞氧化损伤模型的建立方法[8]。在37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h 后，保护组加入 10 μL 终浓度 1，10，20 μmol/L的蛋清五肽溶液，同时损伤组加入10 μL培养基，继续孵育24 h。然后，损伤组和保护组同时加入10 μL 终浓度为400 μmol/L的H2O2溶液，继续孵育12 h后，MTS法测定细胞存活率。

1.3.6 HEK293 细胞 LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX检测 试验分组参照1.3.5节的方法，用6孔板来接种培养HEK293细胞，细胞密度为5.0×105cells/mL，每孔接种量为2 mL（每个浓度设置3个复孔），其中保护组加入250 μL终浓度为0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 μmol/L的蛋清源 五肽WNWAD溶液，最后损伤组和保护组同时加入250 μL 终浓度为400 μmol/L的H2O2溶液。 分组处理完细胞后，吸取细胞培养液备用（LDH试验需要）；各孔加入500 μL细胞裂解液，冰上裂解30 min，然后在4℃下12 000 r/min离心10 min，吸取各组细胞悬液在4℃冷藏备用（6 h内测定完各项酶系指标）。最后按照试剂盒说明书对LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX等指标进行检测。

1.3.7 HEK293细胞线粒体凋亡通路中相关蛋白表达的检测 Western-blot试验参考SaghirAkhtar等[15]和He等[16]的方法并略作修改。将HEK293细胞以密度为7.0×105cells/皿接种到10 cm培养皿中，每皿接种量为8 mL，试验分组情况参照1.3.5节的方法，在37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h。其中保护组加入1 000 μL终浓度为1 μmol/L和10 μmol/L的蛋清源五肽WNWAD溶液孵育24 h，最后损伤组和保护组同时加入1 000 μL终浓度为400 μmol/L的H2O2溶液继续孵育6 h。

然后按说明书提取并测定蛋白含量，取蛋白样品与4×SDS凝胶上样缓冲液混合后煮沸变性，SDS-PAGE电泳分离，湿转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS溶解封闭。再分别与一抗βactin（1∶10 000）、SOD（1∶1 000）、CAT（1 ∶1 000）、Gpx-1（1∶1 000）4℃反应过夜，TBST 溶液洗 3 次。然后加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST溶液洗3次。二抗孵育结束后，采用凝胶成像系统直接扫描成像。

1.4 统计学处理

数据以平均值±标准差（n=3）来表示。使用数据处理软件SPSS19.0版处理。差异显著性通过单因素方差分析（ANOVA）来分析。

2 结果与分析

2.1 蛋清源五肽DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力是评价某种物质体外抗氧化活性的常用的化学方法，此方法具有快速、简便、灵敏的特点。DPPH自由基溶液为深紫色，在520 nm波长处具有最大的吸光度值，当单电子的二苯代苦味肼自由基（DPPH）与抗氧化剂提供的电子或氢原子结合配对时，会使DPPH自由基溶液的特征紫色消失，因此可根据溶液颜色的变化程度来评价某种物质的抗氧化能力。

Trolox清除DPPH自由基的标准曲线如图1所示。以DPPH自由基清除率对Trolox浓度线性拟合得到方程y=0.232x+1.59，R2=0.9935，两者呈良好的线性关系。

不同序列的蛋清源五肽的自由基清除率如图2所示。其中，DPPH自由基清除活性最强的为五肽 CFDVF，在浓度为1，10，100，1 000 μmol/L 时，其自由基清除率分别为2.74%±1.8%%，6.88%±3.9%，11.44%±1.6%，50.14%±2.1%。其它 7种五肽DPPH自由基清除能力相对五肽CFDVF较差。值得注意的是，五肽WNWAD和RIFQW在浓度为1 000 μmol/L时，也具有较高的自由基清除水平，清除率分别为22.88%±1.9%和21.11%±2.5%，五肽 QGYIF，FWIHI，WLKFI，EWTSS，VYQFL的自由基清除率均较差，在1 000 μmol/L时的自由基清除率均低于五肽RIFQW。8种蛋清源五肽对自由基的清除能力均呈浓度依赖性，即随着肽浓度的增大，其DPPH自由基清除活性也随之增强。从结构上看，CFDVF的强抗氧化活性可能与肽链N端的半胱氨酸（Cys）残基有关，半胱氨酸为含硫氨基酸，侧链中的巯基（-SH）为高反应性基团，显弱酸性（pK=8.4），易失去质子，因此半胱氨酸易与二苯代苦味肼自由基（DPPH）中的电子偶合。WN-WAD和RIFQW也具有较强的自由基清除能力，这可能与其N端和C端均为色氨酸（Trp）残基有关，色氨酸为芳香族氨基酸，可通过供氢和DPPH

图1 DPPH自由基清除率的标准曲线Fig.1 The standard curve of DPPH radical scavenging activity

8种蛋清源五肽的抗氧化活性可以通过Trolox抗氧化当量来表示。其中，浓度为1 000 μmol/L时的Trolox抗氧化当量（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC Value）如表1所示，这与通过DPPH自由基清除百分率来表示的趋势一致，其中CFDVF的TEAC值最大，为（209.29±0.49）μmol/L TE/1 000 μmol/L，其次为WNWAD和RIFQW，分别为（91.78±0.29），（84.12± 0.41）μmol/L TE/1 000 μmol/L。

表1 蛋清源五肽的Trolox抗氧化当量Table1 TEAC Value of pentapeptides from egg white

2.2 蛋清源五肽ABTS+·自由基清除能力

图2 蛋清源活性五肽DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging activity of pentapeptides from egg white

ABTS+·自由基清除能力是一种常用的评价生物样品抗氧化能力的方法。在反应体系中，ABTS会被氧化生成ABTS+·自由基，它是一种稳自由基反应，并且其侧链带有一个双环的吲哚基，可通过共振维持稳定。定并可以溶于水的自由基，呈蓝绿色，在734 nm波长处有最大吸光度值。ABTS+·自由基与抗氧化剂反应可以使前者的特征色褪去，进而使吸光度值降低。在同一条件下，生物样品的抗氧化活性强弱和反应溶液吸光度值下降程度成正比。

Trolox清除ABTS+·自由基的标准曲线如图3所示。以ABTS+·自由基清除率对ABTS+·浓度线性拟合得到方程 y=1.0002x+1.7805，R2=0.9946，两者呈现良好的线性关系。

不同序列蛋清源五肽的自由基清除率如图4所示，各条五肽在给出的浓度范围里均呈现出一定的ABTS+·自由基清除能力，Trolox抗氧化当量均呈现出量效关系。在浓度为100 μmol/L时，VYQFL清除ABTS+·自由基能力最强，TEAC值为（94.66±0.37）μmol/L TE，其次为QGYIF，WLKFI，WNWAD，其活性值分别为（92.8±0.36），（88.34±0.59），（86.06±0.43）μmol/L TE。Aliaga等[17]报道了ABTS+·自由基与几种氨基酸的反应机理与动力学。研究表明，反应机理十分复杂，反应速率主要由氨基酸侧链是否有不稳定的氢原子决定，并且与溶液的pH值和样品浓度有关。在同一反应条件下，得到几种氨基酸清除自由基的活性大小排序为：Cys＞Trp＞Tyr＞His。 与上述研究结论一致，ABTS+·自由基清除能力较强的蛋清源五肽中，都含有Cys，Trp，Tyr等易在反应中失去氢原子的氨基酸。由此可见，蛋清源五肽的ABTS+·自由基清除活性和其氨基酸残基的种类有关，不同种类氨基酸残基和自由基反应的活性不同。

图3 ABTS+·自由基清除率的标准曲线Fig.3 The standard curve of ABTS+·radical scavenging activity

图4 蛋清源活性五肽清除ABTS+·自由基能力（TEAC值）Fig.4 Trolox equivalent antioxidant capacity of pentapeptides from egg white

2.3 蛋清源五肽氧自由基吸收能力（ORAC活性）

氧自由基吸收能力（ORAC法）是普遍被接受的抗氧化能力评价方法，可以直接反映抗氧化剂阻断自由基链式反应的能力，是最接近人体生理系统真实反应情况的试验方法，也是用来对食品强化剂和其它植物性治疗药物进行质量控制和检测其抗氧化能力的标准方法。ORAC反应是典型的基于氢原子转移机制（HAT）的氧化过程，氢原子转移是自由基链式反应中的关键步骤，反应后会形成更加稳定的自由基。

图5表示的是蛋清源五肽在浓度为10 μmol/L时的荧光衰退曲线。由图5可知，在对照组（PBS代替抗氧化剂）中，荧光衰减最快，反应开始50 min后，荧光衰减曲线开始趋于稳定，相对荧光强度接近于0，试验组荧光衰减较对照组均放缓，说明蛋清源五肽都有一定的抗氧化活性。其中，五肽WNWAD的抗氧化能力最强，直至140 min后，相对荧光强度才接近0。

蛋清源五肽的ORAC值如表5所示：五肽WNWAD的ORAC活性最强，为（2.53±0.18）μmol/L TE/μmol/L，是排在第二位的RIFQW（1.44± 0.05 μmol/L TE/μmol/L）的1.76 倍。 WLKFI和EWTSS也有一定氧自由基吸收活性，TEAC值分别为（1.39±0.13）μmol/L TE/μmol/L和（1.31±0.11）μmol/L TE/μmol/L。 ORAC 试验中偶氮类自由基（AAPH）热分解后可转化为过氧化自由基，与抗氧化剂发生反应。分析上述4条五肽的共同之处，可以发现肽链中均含有色氨酸（Trp）残基，色氨酸是芳香族氨基酸，由于其特殊结构在反应中易失去氢原子而与自由基发生反应。因此，当色氨酸存在于五肽中时，五肽也会表现出一定的供氢能力。WNWAD与RIFQW相比活性要强很多，可能与色氨酸相邻的氨基酸残基有关，在WNWAD中，Trp在 N端，与天冬酰胺（Asn）残基相接，Trp中的吲哚基双环中含有碳碳双键，可与两者间的酰胺键以及Asn中的酰胺产生吸电子的共轭效应，导致Trp中五元环上氮的电子云密度降低，使氢质子更易释放。RIFQW中Trp在C端，与之相邻的是谷氨酰胺（Gln），Gln和Asn结构相似，只是在R基团中比Asn多了一个亚甲基（-CH2-），减弱了整体的共轭效应，故相比WNWAD，RIFQW的失氢质子能力较弱，从而ORAC活性较低。

2.4 蛋清源五肽对H2O2诱导损伤HEK293细胞存活率的影响

近年来，对蛋清蛋白中分离提取的肽的抗氧化活性研究越来越多[18]，然而其中大多数研究都集中在体外化学评价指标上，如ABTS和DPPH自由基清除率等，只有少数研究利用细胞氧化损伤模型来评价蛋清源肽对氧化应激抑制的生理活性。Kaustay等[10，19]利用人脐静脉血管内皮细胞模型研究发现，从卵转铁蛋白中分离鉴定的三肽IRW和IQW可以有效降低TNF-α介导的超氧阴离子产生。Ding等[20]研究发现，从卵清蛋白中提取的ACE抑制肽同时可以对H2O2氧化诱导损伤的Caco-2细胞模型产生保护作用。由于氧化应激是体内自由基产生和清除的动态过程，应用细胞模型比化学实验更能反应活性肽氧化应激抑制的生理活性和机制，结果更具可靠性。

图5 蛋清源活性五肽清除自由基活性（ORAC法）Fig.5 Peroxyl radical scavenging activity of pentapeptides from egg white

本试验中，采用H2O2氧化诱导损伤的HEK293细胞模型来评价蛋清肽的氧化应激抑制活性。预先使用不同浓度的蛋清肽（1，10，20 μmol/L）孵育细胞24 h，之后再用终浓度为400 μmol/L的H2O2刺激细胞24 h。如图6所示，未加蛋清肽的损伤组细胞存活率仅为对照组的48.5%±2.3%，有显著性差异（P<0.01）；使用不同序列蛋清源五肽处理的细胞，相较于损伤组，细胞存活率均有一定的提高，说明蛋清肽对H2O2氧化诱导损伤的HEK293细胞均有一定保护作用，表现出氧化应激抑制活性。其中，五肽EWTSS的氧化应激抑制活性最差，在浓度为1，10，20 μmol/L 时，细胞存活率分别为对照组的49.8%±3.1%，52.6%±1.8%和53.6%±3.0%；五肽WNWAD的氧化应激抑制活性最强，在浓度为1 μmol/L时，细胞存活率为对照组的98.5%±3.0%，相比损伤组，有显著性差异（P<0.01），随着WNWAD浓度增大，在浓度为10 μmol/L和20 μmol/L时，细胞存活率分别为对照组的89.9%±2.3%和82.6%±3.2%，氧化应激抑制活性反而有减小的趋势，这可能与高浓度的肽抑制细胞生长作用有关，刘志苏等[21]研究发现奥曲肽可以抑制人肝癌细胞生长增殖；李晓艳等[22]报道了降钙素基因相关肽对人血管平滑肌细胞增殖有抑制作用，关于蛋清肽本身对HEK293细胞增殖的影响将在接下来的试验中进行验证。

表2 蛋清源五肽的氧自由基吸收能力（TEAC值）Table2 Oxygen radical absorption activity of pentapeptides from egg white

2.5 蛋清肽对HEK293细胞的毒性作用

如图7所示，蛋清肽对HEK293细胞既无促进生长作用，也无毒性或抑制生长作用，证明蛋清肽本身对试验结果无干扰作用。为了排除试验中的非特异性干扰，在不添加H2O2的情况下，本部分通过MTS法检测了蛋清肽本身对HEK293细胞生长的影响。结果显示，试验组和对照组细胞存活率无显著性差异，蛋清肽本身对HEK293细胞无毒副作用，同时证明，蛋清肽对H2O2诱导损伤的HEK293模型细胞的保护作用是通过抑制氧化应激实现的，而非刺激HEK293细胞增殖。关于2.4节中随着WNWAD浓度增大，氧化应激抑制活性反而有减小的趋势的问题，可以排除与高浓度肽抑制HEK293细胞增殖作用有关，具体原因有待进一步的研究。

2.6 蛋清肽对HEK293细胞中 LDH、MDA、CAT、T-SOD和GSH-PX活性的影响

乳酸脱氢酶（LDH）是一种存在于所有细胞的胞质内的糖酵解酶，丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下可生成乳酸，而丙酮酸和2，4-二硝基苯肼在37℃的碱性环境中可生成红棕色的丙酮酸二硝基苯腙。因此，利用显色反应即可间接检测细胞中乳酸脱氢酶活性。一般情况下，LDH稳定存在于胞质内，如果细胞膜受损，LDH可释放到细胞培养液中，通过检测培养液和细胞内的LDH活性，计算LDH释放率可推断细胞受损程度。由表3可知，H2O2对细胞的损害作用非常明显，LDH释放率为23.07%±0.25%，相比对照组显著升高（P<0.01），而经不同浓度五肽WNWAD处理之后，WNWAD使细胞LDH释放率从21.12%±0.41%（P<0.05）下降到 9.45±0.23%（P<0.01），LDH 释放率显著下降。这说明WNWAD预处理可以提高细胞存活率，保护细胞膜的完整性。

图6 蛋清源五肽对H2O2诱导损伤HEK293细胞的保护作用Fig.6 Protective effect of pentapeptides from egg white on H2O2-induced oxidative damage in HEK293 cells

图7 蛋清源五肽对正常HEK293细胞存活率的影响Fig.7 Effect of pentapeptides from egg white on normal HEK293 cells

丙二醛（MDA）为过氧化脂质产物中的产物，MDA可攻击细胞膜中的不饱和脂肪酸引起细胞损伤。MDA可与硫代巴比妥酸缩合形成红色产物，因此可根据比尔定律，通过检测溶液吸光度值来间接推断MDA含量，从而反映机体内脂质过氧化程度和细胞受损程度。如表3所示，损伤组中MDA含量与对照组相比显著升高（P<0.01），说明过氧化氢可攻击生物膜并引发脂质过氧化反应，形成了大量MDA，保护组中通过加入WNWAD预处理，MDA含量随着肽浓度的增加逐渐减少，并呈浓度依赖型关系，在肽浓度为1.0 μmol/L时，保护组MDA含量与损伤组相比显著降低（P<0.01）。细胞MDA含量的变化，说明WNWAD在一定程度上抑制了细胞内的脂质过氧化作用，增强了细胞的抗氧化防御系统。

表3 WNWAD对HEK293 细胞 LDH、MDA、CAT、T-SOD、GSH-PX的影响（mean±SD）Table3 The effect of WNWAD on LDH，MDA，CAT，T-SOD and GSH-PX in H2O2-induced HEK293 cells（mean±SD）

过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（TSOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）均为细胞抗氧化防御系统中酶类物质的重要组成部分，对机体内氧化和抗氧化动态平衡起着非常重要的影响。过氧化氢酶（CAT）可将H2O2分解为水和氧气；总超氧化物歧化酶（T-SOD）可清除超氧阴离子自由基，防止细胞受损；谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）可促进过氧化氢和GSH反应生成水和GSSG。已有研究表明，H2O2不仅可攻击生物膜并引发脂质过氧化反应，破坏生物膜完整性，而且可以降低细胞内抗氧化酶系活性[23-25]。

如表3所示，经过H2O2处理后，过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性和对照组相比，均显著下降（P<0.01）。经过WNWAD预处理的保护组，随着肽浓度的升高，3种酶的活性均有所提高，呈浓度依赖型关系，尤其在肽的浓度为1.0 μmol/L时，过氧化氢酶（CAT）活力为（20.63 ± 0.51）U/mg蛋白、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力为（179.39±5.73）U/mg蛋白，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）为33.97±5.02个活力单位，较对应损伤组的酶活性均有显著性提高（P<0.01）。

2.7 蛋清肽对HEK293细胞中抗氧化酶CAT、SOD和GPX-1表达的影响

有研究表明，H2O2可以提高细胞内ROS的水平，长期处于含有自由基的环境中，可能导致机体重要的生物大分子遭到破坏，引发DNA突变，造成机体器官组织等的损伤并引发疾病。大量研究表明，氧化应激与多种慢性病和急性病有着密切联系，常见的有心血管疾病、癌症、神经紊乱、糖尿病、缺血再灌注和衰老[26-30]。因此自由基的清除尤为重要。在细胞内，一个控制过量的ROS形成的方法是抗氧化降解酶。在人体抗氧化系统中，SOD1和GPx1作为主要的抗氧化酶分别对超氧化物和过氧化氢自由基进行清除[31]。在本研究中，报道了蛋清源抗氧化肽WNWAD对HEK293细胞中SOD1、GPx1和CAT抗氧化酶活性及表达的影响。

本研究已证明蛋清源活性肽的体外清除DPPH、ABTS和ORAC化学自由基的能力，并且蛋清肽对过氧化氢诱导损伤的HEK293细胞具有保护作用，可以调节细胞中抗氧化酶的活性及MDA和LDH的含量。为进一步证明WNWAD是否通过激活体内抗氧化酶的表达来对HEK293细胞起到保护作用，本部分通过Western-blot试验来检测WNWAD对抗氧化酶蛋白的表达情况。如图8所示，与对照组相比，损伤组经过400 μmol/L的H2O2处理，可下调抗氧化酶蛋白SOD1、GPx1和CAT的水平，这表明H2O2降低了抗氧化酶活性并诱导了HEK293细胞凋亡。同时在保护组中，经过不同浓度 WNWAD（1，10 μmol/L）的预处理后，可以在一定程度上恢复抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT蛋白的表达量，这些结果表明，WNWAD可能通过调节细胞中抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT的活性及蛋白表达水平起到氧化应激抑制活性作用。

图8 WNWAD对SOD，Gpx-1和CAT表达水平的影响Fig.8 Effect of WNWAD on level of SOD，Gpx-1 and CAT protein

3 结论

氧化应激是体内氧化与抗氧化作用失衡而导致产生了大量的中间氧化产物，即产生了过多的自由基。在对不同序列氨基酸组成的蛋清源活性肽（QGYIF，WNWAD，FWIHI，WLKFI，RIFQW，CFDVF，EWTSS和VYQFL）的体外化学清除自由基试验中均表现出一定的抗氧化活性，细胞试验中WNWAD对H2O2诱导的氧化损伤细胞表现出很强的保护作用。H2O2可导致细胞LDH释放率上升，MDA含量增高，而WNWAD可以抑制脂质过氧化进程，维持细胞膜完整性，提高细胞内LDH活性，降低MDA含量；并且提高抗氧化酶CAT、T-SOD和GSH-PX的活性。蛋白质免疫印迹试验表明，WNWAD预处理可在一定程度上恢复H2O2诱导损伤的HEK293细胞中抗氧化酶CAT、SOD和GSH-PX的蛋白表达水平。以上研究结果显示，WNWAD可能通过调节细胞中抗氧化酶SOD1、GPx1和CAT的活性及蛋白表达水平起到氧化应激抑制作用。