宫颈感染高危型人乳头瘤病毒后microRNAs的表达及其临床意义＊

张星莹，杨春娜，于 慧，解水杉，孙晓娟，李连芹

尽管高危型人乳头瘤病毒 （human papillomavirus，HPV）的持续感染是宫颈癌发病的主要原因，但宫颈癌发病是一个多因素参与、多步骤进行的慢性过程。微小 RNAs（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于真核生物中的小分子非编码RNA，通过与相关靶基因结合调控基因的表达，进而参与细胞的各种生理病理过程，如细胞的增殖、分化与凋亡等。近十几年来，miRNA在肿瘤发生、发展、复发、耐药性等方面的作用一直是国内外学者研究的热点问题。大量的研究表明，很多种miRNA在宫颈癌组织中的表达发生异常［1，2］，这些异常表达的 miRNA 与宫颈癌的发生、进展密切相关，甚至可以作为预测肿瘤患者预后的生物学指标［3-5］。 该研究对感染HPV16的宫颈上皮细胞 （未发生癌变或癌前病变）中miRNA的表达变化进行检测，以探讨miRNA在宫颈癌发病中的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料及来源该研究获得滨州医学院烟台附属医院医学伦理委员会批准并取得患者知情同意。宫颈上皮组织来自因子宫肌瘤或子宫内膜异位症接受手术治疗的患者，稳定表达HPV16 E6/E7的宫颈上皮永生化细胞系（H8）购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。HPV检测试剂盒由香港凯普公司生产，提取RNA用Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，miRNA分离试剂盒购自美国Ambion公司，SYBR Green miRNA qRT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 宫颈感染HPV状况的检测 利用HPV检测试剂盒测定宫颈组织的HPV感染状况。从宫颈组织中提取RNA并通过PCR扩增，其产物与杂交膜（含有21种HPV亚型探针，其中高危型15种，低危型6种）进行杂交，杂交膜通过NBT/BCIP显色，以确定HPV的感染与否及分型。

1.2.2 miRNA表达的微阵列分析 微阵列探针是一种寡聚核苷酸，其碱基序列与435种人类miRNA的碱基序列互补。首先从宫颈组织中提取总的RNA，再利用miRNA分离试剂盒分离出微小RNA，利用T4 RNA 连接酶进行标记，最后将含有1.5 μg的杂交液与微阵列杂交膜在42℃下杂交。次日经清洗、空干之后，利用LuaxScan 10K/A 扫描仪（北京博奥公司生产）及微阵列显著性分析软件（significance analysis of microarray，SAM，version 2.1）对基因芯片进行分析，以量化miRNA的表达差异。

1.2.3 实时定量PCR分析 为了验证微阵列分析结果，利用SYBR Green miRNA qRT-PCR试剂盒对表达异常的miRNA进行定量分析。上游引物序列与待测基因的序列完全相同，下游引物是由厂家提供的通用引物。PCR反应条件为：95℃3 min，95℃15 sec，60 ℃ 1 min×40； 反 应 量 为 50 μl。 每 个miRNA的表达水平是相对于U6的相对表达量，计算公式为 2-ΔCt×106，其中 Ct代表每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，ΔCt为每个miRNA基因与U6的阈值循环数之差，即ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。上述实验重复三次。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 20.0统计软件包进行分析处理，所测miRNA的表达强度以（x±s）表示。对于两组间年龄比较，采用t检验法；对于miRNA表达水平的比较，采用单因素方差分析。取P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1患者一般资料该研究选取了10例单纯感染HPV16的宫颈标本，其病理学检查未见异常。患者的平均年龄（48.5±1.8）岁。另外，选取10例HPV阴性的正常宫颈作为对照，其平均年龄（49.8±1.2）岁。两组病例的年龄无明显差异。

2.2 miRNA的表达差异根据SAM的解释，如果挑选表达差异在5倍以上的基因，可能会有1个基因是假阳性。而如果挑选表达差异在3～5倍之间的基因，可能会有2～3个基因是假阳性。因此，笔者挑选了表达差异在5倍以上的基因，而且这种差异出现在6个以上的所测标本中。如表1所示，在HPV16 阳性的宫颈标本中，miR-133a，miR-133b，和miR-196a的表达强度与对照组相比显著降低。

表1 miRNA在HPV16型阳性的宫颈标本中的表达差异倍数

2.3实时定量PCR检测结果为了验证微阵列分析结果，笔者采用实时定量PCR对上述3个miRNA的表达进行了检测。如图1所示，miR-133a，miR-133b，和miR-196a在HPV16阳性的宫颈中的相对表达量显著低于对照组，而且在H8细胞系中表达降低更加明显。

3 讨论

图1 miRNA的表达比较

截至目前，大多数有关miRNA与肿瘤相关性的研究集中于癌症患者或者肿瘤细胞，而miRNA在肿瘤发病起始阶段的作用却鲜见报道。在宫颈癌发病过程中，高危型HPV的致癌基因与宿主细胞的基因组发生整合是非常关键的一步。该研究发现了3个miRNA，其表达在感染HPV16的宫颈细胞中显著降低。H8是一种永生化的宫颈上皮细胞，其中HPV16的E6/E7基因与宫颈上皮细胞的基因组发生了整合。miR-133a、miR-133b、miR-196a在 H8细胞系的表达进一步降低，提示这些基因与宫颈癌的发病密切相关。

众所周知，高危型HPV持续感染是宫颈癌发病的主要因素，而HPV的致癌基因与宿主细胞的基因组发生整合是其中的关键步骤之一。研究发现，HPV的致癌基因与宿主细胞的基因组发生整合的位点常常靠近于c-Myc基因。之前的研究报告提出，HPV的致癌基因E6/E7和c-Myc直接作用于包括 miRNA-196 在内的多个 miRNA［6，7］，而 miRNA-196则对Hoxb8基因发挥负调节作用［8］。Hoxb8是一种重要的转录因子，可以调控细胞的分化［9］。因此推测HPV致癌基因与c-Myc、miR-196和Hoxb8之间，在宫颈癌的发病过程中存在相互作用关系。在该研究所确认的3个miRNA中，miR-133a和miR-133b在各种不同的肿瘤中的表达均降低。国内学者Song等研究发现，miR-133a通过表皮生长因子受体抑制宫颈癌细胞的生长［10］，而根据Patron等人的报告，miR-133b在宫颈癌细胞系HeLa细胞中具有促凋亡作用［11］。miR-133a和miR-133b在HPV16阳性的宫颈上皮细胞中的表达降低，提示此类细胞的凋亡可能受到抑制，或者有利于细胞的生长，其结果促进了HPV致癌基因的复制和整合，进而在其他因素的作用下发生癌变。其中详细的作用机制尚需要进一步研究。