bFGF基因与体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的相关性

刘效波 荆丽杰 刘宝堂 侯文明 李 磊 赵 进 李子军

（潍坊医学院附属医院心血管外科，山东 潍坊 261031）

缺血性心肌病是由冠状动脉粥样硬化引起的心肌长期缺血，导致心肌弥漫性纤维化。临床常表现为，心力衰竭和心绞痛[1-2]。骨髓基质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞总称，存在于骨髓中，能够向多种细胞进行分化，在体外能迅速扩增，广泛的来源，是目前修复各种病症的理想型种子细胞。但在成体动物中仅占有核细胞的十万分之一，在骨髓中也仅仅只占0.25%，含量相对较低，难以广泛应用，在过往的基因治疗研究当中将它作为靶细胞的研究很少[3-4]。本次实验通过bFGF基因体外转染缺血性心肌病患者骨髓基质干细胞的研究，观察标记和检测转染对骨髓基质干细胞的生长增殖所带来的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2010年～2018年我院收治的缺血性心肌病患者48例，其中男性患者23例，女性患者25例，年龄为41～72岁，平均年龄为（54.8±6.9）岁，患缺血性心肌病病程时间平均为3.6年。将所有患者按照随机表法分为观察组和对照组两组，每组24例，其中观察组患者11例，女性患者13例，年龄为45～71岁，平均年龄为（61.8±8.6）岁，患缺血性心肌病病程时间平均为3.4年。对照组患者15例，女性患者9例，年龄为46～68岁，平均年龄为（52.2±7.9）岁，两组患者性别、年龄以及患缺血性心肌病病程等均无明显差异，实验结果具有可参考性。

1.2 纳入和排除标准。纳入标准：①所有患者均符合《2011欧洲心脏病学会非ST段抬高型急性冠状动脉综合征处理指南》[5]标准，诊断为缺血性心肌病。②所有患者均经冠状动脉造影检查，具有明确心肌缺血症状[6-7]。③临床资料完整，经我院伦理委员会批准，所有患者自愿加入本次实验。排除标准：①先天性心脏病、贫血性心脏病以及其他类型的心脏疾病。②肝脏、肾脏等重要功能不全者。③恶性肿瘤患者。④资料不全，配合度不佳的患者。

1.3 治疗方法：征得患者同意的情况下，在进行心外科手术开胸的同时，从患者胸骨骨髓抽取骨髓基质干细胞，4～6 mL，放置于肝素和含有15 mL的100%胎牛血清、100 U/mL链霉素以及100 U/mL青霉素钠的α-MEM混合溶液中，保持37 ℃温度、饱和湿度和5%的二氧化碳中接种于培养皿中，观察显微镜下细胞分裂和增殖情况。16～18 d 80%细胞核出现融合时传代，细胞活性通过台盼蓝试剂进行拒染实验，绘制细胞生长曲线。再取2代细胞，采用Lipofectamine转染试剂将重组真核表达质粒pIRFS2-EGFP-bFGF来转染缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞。

1.4 观察指标：①倒置荧光显微镜观察：在对于骨髓基质干细胞进行转基因后，观察显微镜下4、12、24、48、72 h以及传代后24 h的标志基因荧光蛋白（EGFP）强度表达情况。②转染效率计算：转染效率=EGFP阳性细胞数/总细胞数×100%。③bFGF浓度测定：采用酶联免疫吸附法（ELISE）检测转染后4、12、24、48、72 h培养的上层清液浓度。④细胞爬片免疫组化染色：对48 h后的细胞爬片进行转染，丙酮固定bFGF免疫组化染色，观察是否出现蛋白质水平的bFGF表达，采用488 nm波长激发。

1.5 统计学处理：对于本次实验研究的数据采用SPSS 19.0 软件进行统计分析处理，计量资料采用均数±标准差（±s）来表示，对照组和观察组之间的比较采用t检验；计数资料率的比较采用χ2检验。其中P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者转基因效率对比：见表1。观察两组患者在pIRFS2-EGFPbFGF转染后的荧光显微镜下标志基因EGFP阳性细胞数量和总数的情况，发现最初的标记基因荧光强度最强，从4～48 hEGFP阳性细胞数量逐渐增多，转基因效率逐渐升高，而在48～72 h内强度逐渐减弱，转基因效率反而有所下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组患者转基因效率对比（%，±s）

表1 两组患者转基因效率对比（%，±s）

2.2 两组患者bFGF浓度变化情况：见表2。采用酶联免疫吸附法（ELISE）检测转染后4、12、24、48 h的bFGF浓度逐渐升高到23.5 ng/mL，而在48～72 h内浓度慢慢降低。差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 两组患者bFGF浓度变化情况（ng/mL）

3 讨 论

本次实验发现，采用Lipofectamine转染试剂将重组真核表达质粒pIRFS2-EGFP-bFGF来转染缺血性心肌病患者的骨髓基质干细胞，可以在一定时间内分泌出相对较高水平的bFGF蛋白质，从而有效的促进细胞的分裂和增值，发挥生长因子的活性和生理作用，修复缺血的心肌组织，未来可以考虑作为缺血性心肌病患者的心肌基因治疗靶细胞[9-12]。