花脸香蘑8个菌株液体菌种比较研究*

张国利，吴光宗，2，王光远，王 潼，隋文静，田雪梅**

（1.青岛农业大学山东省应用真菌重点实验室，山东 青岛 266109；2.青岛农业大学植物医学学院，山东 青岛 266109）

花脸香蘑 [Lepista sordida(Schum.:Fr.)Sing.]，属于担子菌门 （Basidiomycota） 伞菌纲 （Agaricomycetes） 伞菌目 （Agaricales） 口蘑科 （Tricholomataceae） 香蘑属（Lepista），是一种珍稀食（药）用菌[1]。新鲜的花脸香蘑菌肉呈浅紫色，菌盖呈浅紫色或藕粉色，有香气散发，故又称其为香蘑，也称紫晶香蘑、丁香蘑、花脸蘑等[2]。该菌蛋白质含量高，必需氨基酸种类齐全，含有丰富的具有抗氧化，增强免疫，抗衰老的硒、锗、锌、铁等人体必需微量元素，具有养血、益神、补肝和益五脏之功效，常食有利于治疗贫血崩漏、久病体虚、神疲、健忘等症，能使肌体及时排毒并增加食欲，令人充满活力[3]。花脸香蘑气味浓香，色泽宜人，味道鲜美，鲜食、干食风味俱佳，是开发价值很高的优良珍稀食（药）用菌。目前花脸香蘑主要以野生为主，但数量稀少且随环境条件变化有日益枯竭的趋势。自2000年以来，国内福建、贵州等地陆续有少量花脸香蘑人工驯化栽培的报道出现[4]，但有关花脸香蘑液体菌种的研究尚未见报道。

液体菌种与传统固体菌种相比，具有发菌时间短、菌种活力高、发菌点多、成本低等诸多优点，越来越多地被用于食用菌研究开发中[5]。从应用和开发的角度出发，通过对花脸香蘑8个菌株液体菌种培养过程中的发酵液pH、菌丝生物量及3种胞外酶活性进行跟踪测定和分析，以期为花脸香蘑人工驯化栽培及进一步开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

花脸香蘑8个菌株，编号分别为Ls1～Ls8，由山东省应用真菌重点实验室分离并保藏。

1.2 液体发酵条件

500 mL三角瓶，装液量200 mL，接种量5%，150 r·min-1，25℃避光振荡培养 8 d[9]。

1.3 测定项目

接种后第4天～第8天，8个菌株每天定瓶定时取20 mL发酵全液，PHS-3C型pH计测定发酵液pH并记录。200目纱网过滤，所得菌球于50℃烘至恒重，计算菌丝生物量，所得滤液5 000 r·min-1离心10 min，上清液即为粗酶液，测定其胞外羟甲基纤维素酶、半纤维素酶和漆酶活性，每组3个重复。

1.4 胞外酶活性测定

1.4.1 羟甲基纤维素酶活力测定

将 1%CMC-Na溶液 0.95 mL 与粗酶液 0.05 mL 充分混匀；40℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷却后蒸馏水定容到12.50 mL，混匀；540 nm下测OD值，另取同样酶液沸水浴5 min灭活作为对照组。每个样品3个重复[6]。葡萄糖含量测定标准曲线y=1.263 8x-0.003，R2=0.999 1。上述条件下，每毫升粗酶液每分钟产生1 μg葡萄糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U·mL-1）。

1.4.2 半纤维素酶活力测定

用 pH 4.8 的 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7缓冲液将粗酶液稀释10倍，吸取0.25 mL至试管中，准确取 10 mg·mL-1的木聚糖 0.75 mL放入试管中；50℃水浴30 min后立即加入DNS 1.50 mL，沸水浴5 min；冷却后定容到12.50 mL，540 nm下测定OD值；另取同样酶液沸水浴5 min灭活作为对照组，每组设置3个重复[7]。木糖含量测定标准曲线y=1.571x+0.009 8，R2=0.999 3。每毫升粗酶液每分钟产生1 μg木糖所需酶量定义为1个酶活力单位（U·mL-1）。

1.4.3 漆酶活性测定

漆酶活性测定采用ABTS法，5 mL的酶活反应体系中，加入 0.5 mmol·L-1的 ABTS 2.0 mL，再加入用 0.2 mol·L-1Na2HPO4-C6H8O7缓冲液稀释 7.5 倍的粗酶液3.0 mL。将底物与酶液混匀后启动反应，每隔3 min记录420 nm处吸光值的变化。每个样品3个重复，用沸水浴灭活的粗酶液作对照[8]。每分钟转化1 μmol ABTS使产物ABTS自由基浓度变化的值定义为1个漆酶单位（U，U·mL-1）。计算公式如下：

式中：△A为连续2次吸光值的差值；V为反应体系总体积；ε=3.6×104L·mol-1·cm-1；L为比色皿直径；t为反应时间；v为样品体积。

2 结果与分析

2.1 不同花脸香蘑菌株发酵液pH变化情况

测定不同花脸香蘑菌株发酵液pH变化情况，结果见图1。

图1 不同花脸香蘑菌株发酵液pH变化情况Fig.1 The pH change in fermentation broth of different Lepista sordida strains

由图1可知，8个菌株液体菌种培养的起始pH为6.10，后随培养的进行pH逐渐下降，在培养的第8天下降至pH 5.60左右，菌株之间无明显差异。

2.2 不同花脸香蘑菌株菌丝生物量变化情况

测定不同花脸香蘑菌株菌丝生物量变化情况，结果见图2。

图2 不同花脸香蘑菌株菌丝生物量变化情况Fig.2 Changes in mycelium biomass of different Lepista sordida strains

由图2可知，随培养时间的增加，参试各菌株菌丝生物量均表现出明显的上升趋势，从培养的第6天开始，增速变缓。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的菌丝生物量始终高于其他6个菌株，在培养的第8天均在8.60 g·L-1以上，其他菌株的生物量则集中在6.60 g·L-1～8.10 g·L-1之间。

2.3 不同花脸香蘑菌株胞外羟甲基纤维素酶活性测定

羟甲基纤维素酶在花脸香蘑菌丝的营养生长阶段，对于碳源的提供起到重要的作用。测定不同花脸香蘑菌株胞外羟甲基纤维素酶活性，结果见图3。

图3 不同花脸香蘑菌株胞外羟甲基纤维素酶活性测定Fig.3 Determination of extracellular hydroxymethyl cellulase activity of different Lepista sordida strains

由图3可知，供试各花脸香蘑液体菌种在培养过程中均可产生羟甲基纤维素酶，多数菌株从培养的第5天开始，羟甲基纤维素酶活力基本维持在30.00 U·mL-1～60.00 U·mL-1。菌株 Ls3 在培养的第 8天时羟甲基纤维素酶活力最高值达到93.02 U·mL-1，其次是菌株Ls7。在培养的第7天，除菌株Ls3和菌株Ls7羟甲基纤维素酶活力增长加快之外，其他菌株的酶活力基本趋于稳定。根据上述试验结果，在培养的第7天～第8天作为液体菌种使用时，菌株Ls3和Ls7分解纤维素类培养料的能力最强，生产潜力大。

2.4 不同花脸香蘑菌株胞外半纤维素酶活性变化情况

测定不同花脸香蘑菌株胞外半纤维素酶活性，结果见图4。

图4 不同花脸香蘑菌株胞外半纤维素酶活性测定Fig.4 Determination of extracellular hemicellulase activity of different Lepista sordida strains

由图4可知，除菌株Ls7和菌株Ls6一直呈上升趋势外，其余菌株均呈现先上升后下降的趋势。其中，菌株Ls5和菌株Ls3的胞外半纤维素酶活力最高值出现在培养的第7天，其他4个菌株的最高值出现在培养的第6天。菌株Ls5、Ls3和Ls7在培养的第7天～第8天，半纤维素酶活力最高值均在3.11 U·mL-1以上。根据以上试验结果推断，在培养的第7天～第8天作为液体菌种使用时，菌株Ls5、Ls3和Ls7分解半纤维素类培养料的能力最强。

2.5 不同花脸香蘑菌株胞外漆酶活性测定

测定不同花脸香蘑菌株胞外漆酶活性，结果见图5。

由图5可知，菌株Ls1、Ls5和Ls3的漆酶活性始终较低且无明显变化。其余5个菌株的漆酶活力均呈现先上升后下降的趋势，8个菌株在培养的第6天达到最高值，随后下降。其中菌株Ls4漆酶酶活力最高为7.79 U·mL-1，其次为菌株Ls2和菌株Ls6。因花脸香蘑属于草腐菌，所以漆酶活力对于其对培养基质的分解能力影响较小。

图5 不同花脸香蘑菌株胞外漆酶活性测定Fig.5 Determination of laccase activity of different Lepista sordida strains

3 结论

在液体菌种的筛选过程中，通常需要根据菌种生物量以及菌种对培养料的分解利用能力等方面进行考察。通过跟踪测定8个花脸香蘑菌株液体菌种培养过程中发酵液pH、菌丝生物量以及胞外羟甲基纤维素酶、半纤维素酶和漆酶活力，对供试菌株进行综合考察和筛选。

由于花脸香蘑属草腐性真菌，因此其对于培养料的利用主要以纤维素、半纤维素类成分为主，为筛选优良液体菌种，菌丝生物量、羟甲基纤维素酶和半纤维素酶活力是主要考察因素。而漆酶作为具有分解木质素类成分功能的酶，其活力高低对于花脸香蘑利用培养料的能力有一定的辅助作用[10]。综合本研究的各项结果，菌株Ls3的液体菌种在培养的第7天～第8天，具有较高的菌丝生物量和羟甲基纤维素酶、半纤维素酶活性，是优良的液体菌种工程菌株。当培养料中含有一定木质素类成分时菌株Ls7作为液体菌种进行使用也具有一定的优势。该结果为花脸香蘑人工栽培技术和优良菌株选育等相关研究提供了一定的理论基础和实践依据，将有力促进这一珍稀食用菌品种的推广应用。