免疫分子诊断急性髓系白血病患者PML/RARα融合基因重排的诊断效能评价

邹惠安 李琳芸 唐元艳 陈永玲 梅冰

长江大学第二临床医学院（湖北荆州434020）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是临床上常见的白血病类型，主要发生于成人，发病率随着年龄的增加而升高。大多数患者表现为发热、贫血、出血，严重的出血倾向可致命，因此白血病快速、准确的诊断尤为重要。白血病的诊断需要结合多种检测方法，包括形态学、组织学、细胞化学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学方法［1］。免疫表型主要检测相关免疫分子，基因重排检测是评估患者病情和疗效的重要分子生物学指标，两者之间存在一定关联，如B 细胞型急性淋巴细胞白血病患者CD25 是融合 基 因BCR/ABL1 标 志 性 抗 原，CD66c、CD13、CD10 和CD38 与BCR/ABL1 相关［2-5］。目前，关于AML 患者免疫分子与融合基因表达关联性的研究较少，本研究选取初诊FAB 分型为AML 的患者，流式细胞术检测多个免疫分型免疫分子表达，荧光定量PCR 方法检测融合基因PML/RARα表达，探讨免疫分子与PML/RARα 融合基因之间的关系及免疫分子对PML/RARα融合基因的诊断效能，为AML 患者临床诊疗提供新的实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料患者来自2016年7月至2019年2月荆州市中心医院血液内科初诊住院病例，纳入标准：（1）诊断符合张之南等主编《血液病诊断及疗效标准》［6］中AML 的相关诊断标准；（2）明确分型、骨髓和外周血原始细胞比例，细胞和分子遗传学资料完整。排除标准：骨髓增生异常综合征转化型AML、治疗相关AML 及其他类型非原发AML［7］。本研究共纳入120 例符合要求的AML患者，男66 例，女54 例，年龄15 ～76 岁。以39 例PML/RARα阳性患者作为研究组，其中L 型34 例，S 型2 例，V 型3 例，81 例PML/RARα阴性患者作为对照组。采集标本时获得患者知情同意，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞术检测免疫分型CD 分子表达采取骨髓标本3 mL，EDTA 抗凝，于各检测管中加入相应单克隆抗体10 μL，并加入标本75 μL，振荡混匀，室温避光20 min 后，加入红细胞裂解液，混匀避光10 min 后，加入1 mL PBS 洗涤，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。胞浆内MPO 的染色首先标记表面抗体，加入固定液100 μL，室温避光15 min，加入3 mL PBS 洗涤离心去掉上清，加入0.1 mL溶血透膜剂5 min，加MPO 抗体室温避光15 min，1 500 r/min 离心5 min，弃上清。通过Epics-XL 型流式细胞仪CD45/SSC 设门对104个细胞进行检测，通过CytExpert 软件分析细胞的免疫分型CD分子表达。检测的CD 分子主要有CD19 、CD10、CD5、CD20、CD2、CD4、CD3、CD8、CD7、CD15、CD14、CD13、CD33、HLA-DR、CD56、CD16、CD64、CD11b、CD117、CD34、CD38、cMPO。以表达百分比＞20%判断为阳性。

1.2.2 总RNA 提取及融合基因PML/RARα 检测采集EDTA 抗凝骨髓2 ～3 mL，Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞。Trizol 法提取总RNA，紫外分光光度仪检测RNA 浓度和纯度。PML/RARα检测试剂盒购于厦门至善生物科技股份有限公司，以RNA 为模板检测PML/RARα融合基因的表达，方法按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法采用SPSS 24.0 统计学软件，计数资料率的比较采用χ2检验或Fisher′s 精确检验；计量资料采用动差法计算峰度系数和偏度系数，进行正态性检验，若符合正态分布以均数±标准差表示，比较用独立样本t检验；不符合正态分布用M（P25，P75）形式描述，采用非参数秩和检验。通过受试者工作曲线（ROC）评估最佳敏感性和特异性的截止点［8］。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PML/RARα 阳性组与PML/RARα 阴性组免疫分子阳性患者率比较两组患者均表达CD117分子，均不表达CD14、CD10、CD20、CD3 和CD8 分子。在PML/RARα 阳性患者组中CD64 阳性患者率较高（75.0%），在PML/RARα 阴性患者组中阳性率较低（28.6%）；在PML/RARα 阳性患者组中CD7、CD34、HLA-DR 阳性患者率均较低，在PML/RARα 阴性患者组中阳性率较高。两组间CD64、CD7、CD34、HLA-DR 阳性率差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 PML/RARα 阳性患者组与阴性患者组免疫分子阳性细胞率比较采用动差法对免疫分子阳性细胞率进行正态性检验，资料不服从正态分布，组间比较用非参数秩和检验，PML/RARα阳性患者中CD64 阳性细胞率四分位数均高于PML/RARα 阴性患者，CD7、CD34、HLA-DR阳性细胞率四分位数均低于PML/RAR α 阴性患者。两组间CD64、CD34、HLA-DR 阳性细胞率差异均具有显著统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 免疫分子诊断AML 患者PML/RARα融合基因重排的ROC 曲线分析CD34、HLA-DR 和CD64对判断PML/RARα融合基因是否为阳性有一定的准确性（ROC 曲线下面积介于0.7 ～0.9）。CD34 阳性细胞率临界值10.7%、HLA-DR 阳性细胞率临界值11.1%和CD64 阳性细胞率临界值14.2%可用于预测和诊断AML 患者PML/RARα融合基因是否发生了重排。共阳性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比单标记物具有更高的特异度。见表3。

表1 PML/RARα 阳性患者组与阴性患者组免疫分子阳性患者率比较Tab.1 Comparison of immunomolecule positive patient rates between PML/RARα positive and negative groups

表2 PML/RARα 阳性患者组与阴性患者组免疫分子阳性细胞率比较Tab.2 Comparison of immunomolecule positive cell rates between PML/RARα positive and negative groups M（P25，P75）

表3 CD7、CD34、HLA-DR、CD64 对PML/RARα融合基因的诊断价值Tab.3 Diagnostic value of CD7，CD34，HLA-DR and CD64 to fusion gene PML/RARα

3 讨论

AML 是一组以髓系造血干祖细胞恶性增殖为特点的血液系统恶性克隆性疾病，可发生于任何年龄，无明显性别差异［9］。PML-RARα对AML 发病机制可以从细胞、基因转录与表达的角度阐述：首先，PML-RARα的表达可以导致细胞周期抑制物p21 的上调，增加基因组的不稳定性。p21 对AML 中M2、M3 起着重要的作用，在没有p21 的情况下，APL 干/祖细胞的长期生存能力明显减弱［10］。其次，PML-RARα 能够抑制某些miRNA 的转录，间接影响在白血病发生中具有重要功能的基因的转录调控。例如PML-RARα 可通过调节miR-196a的表达进而起到调控HOXB8 效果［11-12］。最后，PML-RARα 可以通过与转录因子相互作用，干扰/抑制了其他转录因子的下游转录调控的分子通路。研究发现PML-RARα 能够与转录因子AP-1、GATA2、Sp1、NF-Y 和PU.1 等相互作用从而干扰了它们自身的转录活性和其对靶基因的调控，其中PU.1 是抑制髓系细胞发育分化至关重要的转录因子，PML-RARα 与PU.1 相互作用，干扰其靶基因的正常转录，从而影响AML 细胞发展［12-15］。因此，PML-RARα对AML 部分亚型的发病和预后至关重要。

AML 常见高表达抗原有CD33、CD13 和MPO。但CD13、CD33 也高表达于ALL，对AML 诊断无特异性，因此不能单独作为诊断AML 指标［16-17］。CD34 和HLA-DR 属于干/祖细胞的相关抗原，二者多在低分化的亚型中表达［18］；CD33+CD13+CD34-HLA-DR-被认为是APL 特征性的免疫表型［19］，本研究符合上述研究结果：所有PML/RARα阳性患者均有此免疫表型，其中CD33、CD13 表达阳性率均为100%，而CD34 与HLA-DR 表达率很低。梁艳［20］、张建军等［21］开展了类似研究，发现AML 中NPM1 基因突变阳性患者组的CD34 和HLA-DR阳性患者率明显低于NPM1 基因突变阴性患者组；AML-1/ETO 融合基因阳性患者的CD34 和HLA-DR 阳性患者率显著高于APL 患者。目前，尚未见PML/RARα 融合基因的表达分析与AML 白血病细胞免疫表型的研究报道。本研究比较了PML/RARα 融合基因阳性与阴性的AML 患者白血病细胞的免疫分子阳性患者率，发现与PML/RARα融合基因阴性患者组比较，PML/RARα融合基因阳性患者组的CD64 阳性患者率明显偏高，而CD7、CD34 和HLA-DR 阳性患者率明显偏低。

曹春等［22］研究发现RUNX1-RUNX1T1 阳性患者中CD7、CD34、HLA-DR 阳性细胞率中位数高于RUNX1-RUNX1T1 阴性患者，CD64 阳性细胞率中位数低于RUNX1-RUNX1T1 阴性患者，但阳性细胞率中位数的差异无统计学意义。本研究分析PML/RARα 融合基因阳性与阴性的AML 患者白血病细胞的阳性细胞率，发现PML/RARα 阳性患者的CD64 阳性细胞率四分位数均高于PML/RARα阴性患者，CD7、CD34、HLA-DR 阳性细胞率四分位数均低于PML/RARα 阴性患者。两组间CD64、CD34、HLA-DR 阳性细胞率差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

KALINA 等［2］发现TEL/AML1 和MLL/AF4 阳性患者从未出现CD66c 的表达，而B-ALL 的亚型“Phlike-ALL”中BCR/ABL1 与CD66c 具有相关性。其它研究发现CD25 是融合基因BCR/ABL1 标志性抗原，CD13，CD10 和CD38 可能与融合基因BCR/ABL1 相关，而CD66c 和CD34 对BCR/ABL1 基因重排的预测性较差［3-5］。此外，研究发现联合使用多个抗原分子时，会增加相关基因预测的特异性并降低敏感性［5］。本研究发现共阳性CD7/CD34、CD7/HLA-DR 和CD34/HLA-DR 比单标记物具有更高的特异性。CD34/HLA-DR 具有非常高的特异性和敏感性，因此CD34 和HLA-DR 联合检测可以作为AML 诊断的标志，值得更深入的研究。通过ROC曲线分析CD34、HLA-DR 和CD64 对PML/RARα融合基因阳性的临床诊断价值，结果表明CD34、HLA-DR 和CD64 对判断AML 患者PML/RARα是否为阳性有一定的临床诊断价值（P＜0.01）。因此，CD34 阳性细胞率临界值10.7%、HLA-DR 阳性细胞率临界值11.1%和CD64 阳性细胞率临界值14.2%可用于诊断AML 患者PML/RARα融合基因重排和表达，临床可根据上述免疫分子表达水平对PML/RARα融合基因重排进行预判，及时开展融合基因的相关检测以进一步确诊和明确病情，为患者得到及时有效的诊疗提供帮助。考虑到仪器测量误差以及样本的局限性，这些免疫分子的诊断临界值需要进一步研究和确认。

总之，本研究通过分析AML 初诊患者免疫分型与PML/RARα 融合基因的关系，发现AML 患者中免疫分子CD34、HLA-DR 和CD64 对诊断急性髓系白血病患者PML/RARα 融合基因重排有较好的性能。