新疆冷水鱼肠道肉杆菌遗传差异及抑菌特性分析

魏小晶，赵志霞，罗宝龙，张瑞蕊，张 艳，倪永清,*，周 红,*

（1.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003；2.石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003）

动物肠道是一个开放的生态系统，其中栖息着大量的微生物[1]。肠道微生物作为宿主消化系统的重要组成部分，在促进宿主的食物消化、维持微生态平衡及调节免疫等方面起着不可替代的作用[2-3]。研究发现，肠道微生物与宿主之间形成了复杂而又相对稳定的动态关系，确保宿主的健康和肠道微生物的平衡。此外，不同物种间或者同一物种不同群体之间，甚至是同一群体不同个体之间的肠道微生物结构都有差异[4-5]。Cummings等[6]发现单胃动物的肠道微生物与其生理代谢功能紧密相关。鱼类作为一种独特的脊椎单胃动物，属于变温动物，体温随水温的变化而变化，其微生态系统的构成主要取决于食性和生存的水体环境[7]，也使得鱼类肠道微生物明显不同于陆生脊椎动物。

近年来，有关鱼类消化道微生物的研究开始备受关注[8]，大部分集中于鱼类食性、生存环境和肠道微生物的相关性研究。相对于人类和陆生高等脊椎动物，由于鱼类属于变温动物，其生存的大部分水体环境温度较低，为筛选到耐低温的益生乳酸菌提供了良好的来源，尤其是产细菌素的耐低温乳酸菌在食品的生物保鲜技术方面具有广阔的市场前景。研究发现，部分乳酸菌除能代谢产生有机酸及过氧化氢等物质外，还能产生细菌素类活性物质[9]，能有效地抑制食品中病原菌及腐败菌的生长繁殖[10-11]，这些具有抑菌特性的低温乳酸菌在饲料行业及食品冷藏保鲜中极具应用潜力[12]。有研究报道，鱼类肠道不仅能分离得到Lactobacillus和Enterococcus，同时还分离出多种Canobacterium菌株[13]。Sugita等[14]从鱼肠道分离出Aeromonas caviae、A. hydrophila、Pseudomonas spp.及Clostridium spp.等细菌对部分气单胞菌属及人源病原菌显示不同程度的抗菌效果。目前，国内外从水产品中分离筛选具有抑菌效果肉杆菌的研究也有报道，Ring等[15]从大西洋鲑鱼、嘉鱼等4 种鱼肠道中筛选到7 株栖鱼肉杆菌（C. piscicola）和3 株广布肉杆菌（C. divergens），分析了它们对水产品致病菌的抗菌特性，研究表明这些肉杆菌能够产生有效拮抗水产品中腐败菌和致病菌的抗菌肽。然而，肉杆菌在带给人们益处的同时也出现了一些亟待解决的问题，如有些肉杆菌产生了抗生素耐药性或自身存在天然耐药性，肉杆菌耐药性与食品安全性相关问题逐步引起了人们的关注，益生肉杆菌的安全性评估已十分必要。

新疆额尔齐斯河是我国唯一注入北冰洋水系的外流河，常年水温在20 ℃以下，其中多产冷水鱼类，为研究冷水鱼肠道低温肉杆菌提供了可靠来源。本实验从新疆冷水鱼肠道中分离筛选低温肉杆菌，对其遗传结构差异进行分析，筛选明显具有抑菌活性的肉杆菌，对该菌株发酵上清液中组分进行分析和该菌株对部分药物的敏感性进行实验，以期为低温肉杆菌作为益生素在鱼类饲料添加剂方面的应用提供科学依据，为食品的低温贮藏保鲜及肉杆菌的安全性评估提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采自新疆额尔齐斯河流域的冷水鱼包括河鲈（Perca fluviatilus）、红尾鱼（Rasbora borapetensis）、银鲫（Carassius auratus gibelio）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）、黑斑狗鱼（Esox reicherti）、叉尾斗鱼（Macropodus opercuiaris）及高体雅罗鱼（Leuciscus baicalensis）。每种鱼按年龄、体质量标记后置于4 ℃冰箱保藏，12 h内运回实验室。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增引物 上海捷瑞生物有限公司；Marker 天根生化科技（北京）有限公司；PCR Master Mix、ddH2O生工生物工程（上海）股份有限公司；0.22 μm微孔滤膜上海兴亚净化材料厂；培养基（Elliker、MRS、LB）、抗生素 北京博奥拓达科技有限公司。

单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes CGMCC 1.9136）、大肠杆菌（Escherichia coli EPEC O127:K63 CICC 10411）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CICC 21600） 中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与设备

5810R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；TC-512 PCR仪 德国Biometra公司；PowerPac Universal水平电泳仪、Gel DOC XR凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；UVmini-1240紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离纯化

将处理好的冷水鱼肠道样品依次按10 倍梯度稀释，分别选取10-2、10-3、10-4和10-5梯度的菌悬液均匀涂布于MRS和Elliker培养基上，每个稀释度涂布3 个平板，分别置于无氧和有氧的条件下，16 ℃培养3～5 d。发现菌悬液稀释度为10-3时平板上菌落均匀明显，且菌落数在30～300 CFU/皿之间。挑取平板表面单一菌落进行划线分离，传代划线培养3～4 次直至纯化，对每个菌株进行镜检，革兰氏染色以及接触酶实验，从而达到对疑似乳酸菌的初步分离筛选，-20 ℃保存备用。

1.3.2 菌株生理生化鉴定

按照Dong Xiuzhu等[16]方法进行糖发酵实验，实验重复3 次并做空白对照。

1.3.3 最适生长温度的测定

将筛选得到的菌株活化后按2%的接种量接种于MRS液体培养基中，分别设4、15、18、24、30、37 ℃ 6 个温度梯度，培养箱中培养24 h，采用紫外分光光度计于420 nm波长处测定OD值。

1.3.4 16S rRNA基因PCR扩增及系统发育分析

DNA的提取根据Justé等[17]改良后的十六烷基三甲基溴化铵方法进行。采用16S rRNA通用引物27f（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）进行PCR扩增，扩增条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环。PCR产物在1.5 g/100 mL琼脂糖凝胶电泳检测后，送往上海美吉公司进行测序。测序结果被提交至GenBank数据库中进行序列同源性比对（BLAST），采用CLUSTAL X1.83软件排列对齐序列[18]并采用MEAG v.5.0[19]软件建立系统发育树。

1.3.5 多重聚合酶链式反应（repetitive polymerase chain reaction，rep-PCR）指纹图谱分析

指纹图谱采用两种rep-PCR引物BOXAIR和（GTG）5（表1）。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶、1×TAE电泳缓冲液、80 V电压下电泳3 h，置于凝胶成像仪下拍照，将得到的指纹图谱使用Gel ComparII（Applied Maths, sint-Martens-Latem，Belgium）凝胶分析软件依据UPGMA进行聚类分析。

表1 rep-PCR引物和PCR条件Table 1 Primer sequences and reaction conditions used in rep-PCR

1.3.6 菌株无细胞发酵上清液的制备及抑菌活性菌株的初筛

将分离到的菌株活化后，按2%的接种量接种于MRS液体培养基中，16 ℃振荡培养48 h后，取2 mL发酵液离心（12 000×g，10 min，4 ℃）获得上清液，并用0.22 μm微孔滤膜过滤得到无细胞发酵上清液，4 ℃保存备用。

采用牛津杯法[20]对乳酸菌进行抑菌活性的初筛。将指示菌株大肠杆菌、单核细胞性李斯特菌和金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养基中，37 ℃培养18～24 h，取1 mL指示菌培养液于无菌生理盐水中连续梯度稀释，得到浓度约为106～107CFU/mL的稀释液。取100 µL菌悬液均匀涂布于LB培养基表面，将牛津杯轻轻按压于其上，再向杯中加入200 µL无细胞发酵上清液，以不加菌的MRS培养基为空白对照，4 ℃预扩散3 h后，37 ℃恒温培养18 h，测定抑菌圈直径，每个实验做3 个平行，求平均值以确定抑菌能力。

1.3.7 对无细胞发酵上清液的处理

以单核细胞性李斯特菌作为指示菌，对乳酸菌无细胞发酵上清液进行以下处理：调节发酵上清液pH 6.5后加入过氧化氢酶（质量浓度为5 μg/mL），37 ℃水浴2 h；为明确无细胞发酵上清液中抑菌物质的蛋白质性质，向上清液中分别加入蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶（质量浓度为1 mg/mL），37 ℃水浴2 h。以未经任何处理的无细胞发酵上清液为空白对照进行抑菌实验，结果平行测定3 次取平均值。

1.3.8 药敏实验

根据美国临床实验室标准化委员会标准CLSI（2012）[21]，采用药敏纸片琼脂扩散法（K-B法）对肉杆菌进行15 种抗生素药敏实验。吸取150 µL浓度为107～108CFU/mL的肉杆菌菌悬液，使用无菌棉签将其均匀涂布于MRS琼脂平板表面，待培养基表面干燥以后将药片贴于其上，37 ℃倒置培养36 h，观察抑菌结果，检测抑菌圈直径，每种抗生素药片3 个平行。

1.4 数据处理

每个实验重复3 次，采用SPSS 17.0软件对糖发酵代谢情况进行系统聚类分析；采用Gel Compar II凝胶分析软件进行指纹图谱聚类分析，热图的绘制采用Heml 1.0软件。

2 结果与分析

2.1 菌株分离与鉴定

从7 种冷水鱼肠道样品中共分离出48 株纯培养物，通过肉眼观察菌落大小、颜色，镜检菌落形态以及革兰氏染色和接触酶实验确定疑似乳酸菌，进一步对其进行16S rRNA序列分析，最终确定有15 株为肉杆菌，其中麦芽香肉杆菌（C. maltaromaticum）4 株，广布肉杆菌（C. d i v e r g e n s）1 0 株，未鉴定的肉杆菌属（Carnobacteriumsp.） 1 株。

2.2 菌株生理生化鉴定

根据Dong Xiuzhu等[16]的方法对15 株肉杆菌进行糖发酵实验，糖发酵代谢结果使用SPSS软件进行系统聚类，根据糖发酵代谢情况（表2）可以将肉杆菌菌株聚为7 类，其中菌株E-BYC-2、E-BYC-1和E-BYC-4聚在一起，碳源代谢情况相似，且仅能利用4 种糖类作为碳源，碳源利用率较低；菌株M17-HWYC-3和E-HBGC-4聚为一类，可以利用6 种糖类作为碳源，BS-JYC-3和E-HLM-6也聚在一起，可以利用7 种糖类，碳源利用率较高，而菌株E-BYC-3独自成一分支，可以利用所有的糖、醇为碳源，菌株对碳源的不同利用情况可能与鱼的不同种类及生活习性有关。将15 株肉杆菌分别置于不同温度梯度下培养，最终结果表明菌株的最适生长温度为24～30 ℃，生长温度范围为4～37 ℃，属于耐冷菌范畴[22]，故从冷水鱼肠道分离到15 株肉杆菌属于低温乳酸菌。

表2 肉杆菌糖发酵代谢谱Table 2 Sugar metabolism spectra of 15 Carnobacterium strains

2.3 基于rep-PCR指纹图谱分析

图1 基于rep-PCR扩增的15 株肉杆菌的聚类图Fig. 1 Dendrogram of 15 Carnobacterium strains according to their genetic profile obtained by rep-PCR

对15 株肉杆菌进行rep-PCR指纹图谱分析，采用Gel Compar II软件将两种不同引物对应的指纹图谱进行聚类，由BOX-PCR和（GTG）5-PCR指纹聚类图（图1）可以清晰看出，15 株肉杆菌的指纹图谱带型较丰富，能够反映菌株在种水平上的遗传差异。其中BOX-PCR指纹图谱的条带主要集中在400～5 000 bp范围内，包括3～10 个明显的亮带，大多数产物的条带数多于5 条，并有一些弱带；（GTG）5-PCR指纹图谱在350～5 000 bp范围内并有1～12 个相对明显的条带。比较由2 种不同引物产生的指纹图谱可知，大多数PCR产物条带在350～5 000 bp之间。

由图1可知，在45%的相似性水平上，所有的菌株被聚类成4 簇，Cluster I由4 株C. maltaromaticum组成，其中菌株M17-GYM-3、M17-GYM-2和EB2-4的带型相似，而菌株M17-HWYC-4的带型与它们相差较大，尤其是（GTG）5-PCR扩增的指纹图谱条带更为明显。Cluster II和Cluster III都由C. divergens组成，在60%的相似性水平上均可被进一步划分为2 个小组，且每一小组指纹图谱带型相近。Cluster IV仅由1 株肉杆菌属Carnobacteriumspp.组成，菌株E-BYC-3与其他菌株的带型相差最大，独自成一组。带型统计显示，4 株C. maltaromaticum有2 种带型，10 株C. divergens有4 种带型，Carnobacteriumspp.仅有1 种带型。本实验中15 株肉杆菌遗传多样性丰富，这些肉杆菌种间具有明显的差异，种内带型多样，存在极高的遗传多态性。

2.4 抑菌活性菌株的筛选

采用牛津杯法对15 株肉杆菌进行抑菌活性的初筛，其中8 株肉杆菌对大肠杆菌、单核细胞性李斯特菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用（表3）。

表3 具有抑菌活性肉杆菌的初筛结果Table 3 Primary screening of Carnobacterium for antibacterial activity

2.5 肉杆菌无细胞发酵上清液的抑菌物质分析

表4 肉杆菌菌株的无细胞发酵上清液不同处理后对单核细胞性李斯特菌抑菌活性的影响Table 4 Effect of exclusion of organic acids and hydrogen peroxide on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants ofCarnobacterium strains against L. monocytogenes

乳酸菌在发酵过程中会产生大量的有机酸、过氧化氢、抗菌肽和细菌素等抑菌物质，为明确肉杆菌发酵上清液中的抑菌物质组成，以单核细胞性李斯特菌为指示菌，初筛得到8 株肉杆菌对其均有较好的抑制作用。经酸排除后，如表4所示，菌株M17-GYM-3的抑菌能力明显下降，而其余菌株的发酵上清液均具有明显的抑菌能力，表明有机酸可能对菌株M17-GYM-3抑菌能力的影响较大；肉杆菌发酵上清液经排除酸和过氧化氢后，仍具有明显的抑菌能力，表明过氧化氢对菌株发酵上清液中抑菌活性的影响较小，其中菌株M17-HWYC-4和E-HBGC-4对单核细胞性李斯特菌的抑菌效果最为明显。

对8 株肉杆菌发酵上清液进行蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶处理。如表5所示，除菌株BS-JYC-3经胰蛋白酶处理抑菌活性未丧失外，其余菌株通过3 种酶的酶解实验后抑菌能力完全丧失，即肉杆菌发酵上清液中的抑菌物质对蛋白酶敏感，具有蛋白质的性质[23]，抑菌物质组分中可能存在类细菌素。

表5 3 种蛋白酶处理肉杆菌菌株发酵上清液后对单核细胞性李斯特菌抑菌活性的影响Table 5 Effect of digestion with three proteases on the antibacterial activity of cell-free fermentation supernatants of Carnobacterium strains against L. monocytogenes

2.6 抑菌活性肉杆菌菌株系统发育分析

图2 基于16S rRNA序列肉杆菌的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of Carnobacterium based on 16S rRNA gene sequence

将8 株具有抑菌活性肉杆菌的16S rRNA部分基因序列与GenBank数据库中已知的16S rRNA基因序列进行同源性比对，选取序列相似性高的菌株构建系统发育树见图2，该8 株乳酸菌菌株均属于肉杆菌属。其中菌株E-HLM-6、E-BYC-2、BS-JYC-3和E-BYC-1与C. divergens的序列相似性达99%，M-TZM-3、M17-HWYC-3、E-HBGC-4在同一分枝，与C. divergens亲缘关系较近，菌株M17-GYM-3与已知种C. maltaromaticum的序列相似性达99%以上。

2.7 抗生素耐药性分析

如图3所示，8 个菌株对氨苄西林、米诺环素和氯霉素表现敏感，对庆大霉素、四环素、利福平、替考拉宁表现中度敏感，而所有的菌株对阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、万古霉素和左氧氟沙星等几种抗生素表现耐药。

图4 可以直观反映8 株肉杆菌产生的抗生素抑菌圈直径大小，宏观反映乳酸菌的抗生素耐药情况。颜色从蓝色向绿色、黄色和红色的渐变过程代表了抗生素抑菌圈直径从小到大的递增过程。从热图整体分析，蓝色区域主要集中在苯唑西林、阿米卡星、万古霉素、替考拉宁、左氧氟沙星和氨曲南6 种抗生素中，表明这些抗生素对几乎所有的菌株无抑菌圈产生，即表现耐药；而图中多数颜色主要集中分布在绿色到红色的渐变过程中，表明大部分菌株的抑菌圈直径呈依次增大的趋势，即抗生素耐药情况呈中度敏感或敏感。从热图横向分析，其中菌株M-TZM-3中红色区域出现最多，表明有多种抗生素产生的抑菌圈直径最大；菌株E-BYC-2和E-BYC-1的颜色区域分布相似，即它们的耐药表型相近。从纵向分析，同种类型的抗生素耐药性也可能不同，如青霉素类中苯唑西林所占的蓝色区域远多于青霉素和氨苄西林，即苯唑西林耐药性远大于青霉素和氨苄西林。

3 讨 论

研究发现大部分乳酸菌代谢产生有机酸、过氧化氢及细菌素等抑菌物质，能有效抑制食品中腐败菌及致病菌的生长，在开发低温微生物源生物保鲜剂方面极具应用潜力[24]。分子生物学方法被越来越多地应用于乳酸菌的分离与鉴定，本实验结合乳酸菌的传统分离鉴定方法，最终确定有15 株乳酸菌为肉杆菌。根据Morita[22]对耐冷菌的定义，15 株肉杆菌的最适生长温度为24～30 ℃，属于耐冷菌的范畴。本实验分离到的15 株肉杆菌，其中C. maltaromaticum 4 株，C. divergens 10 株，Carnobacterium spp. 1 株。rep-PCR指纹技术是一种快速、易于操作和可重复性的工具，具备高的分辨能力，可用于区分在种、亚种及菌株水平上的多种与食品相关的乳酸菌[25]。Gevers[25]和Švec[26]等采用该指纹图谱技术研究了乳酸菌的遗传分化，（GTG）5-PCR被发现是最适合乳酸菌高分辨率的鉴定方法，为更准确地反映15 株肉杆菌菌株间的遗传多样性，本研究采用BOXAIR和（GTG）5两种不同引物的rep-PCR指纹图谱技术对筛选到的肉杆菌进行遗传差异性分析，发现15 株低温肉杆菌种间具有明显的差异，种内带型多样，存在极高的遗传多态性，与Bello等[27]的研究结果一致。

Martin-Visscher等[28]研究表明C. maltaromaticum UAL307发酵液的有效成分为IIa类细菌素，陈琳等[29]从植物乳杆菌KLDS1.0391的发酵液中截留出了细菌素，Tulini等[30]从鱼中筛选出的C. maltaromaticum C2所产抗菌肽等物质能有效抑制腐败菌和致病菌的生长。本实验对从新疆冷水鱼肠道中分离得到的每株肉杆菌进行抑菌活性检测，初筛得到8 株肉杆菌对病原菌有明显的抑菌活性，从系统发育来看，7 株属于C. divergens、1 株属于C. maltaromaticum。以单核细胞性李斯特菌为指示菌，通过酸排除、过氧化氢酶实验及蛋白酶消化实验最终确定肉杆菌的抑菌物质成分中可能存在类细菌素。因此，对新疆冷水鱼肠道中低温肉杆菌产细菌素的进一步深入研究是非常关键的。

尽管致病性乳酸菌并不多见，但耐药性问题是乳酸菌在应用安全方面的首要问题[31]，菌株对抗生素的敏感性也是最主要的安全特性[32]。Liu Chang等[33]对46 株乳杆菌研究耐药性发现这些菌株对氯霉素、红霉素、四环素敏感，对万古霉素、链霉素、庆大霉素耐药。Temmerman等[34]对187 株乳酸菌检测耐药性，发现有30 株嗜热链球菌对四环素、红霉素、青霉素和氯霉素敏感，对卡那霉素、万古霉素耐药。本研究采用纸片扩散法对8 株具有抑菌活性的肉杆菌进行15 种抗生素敏感性测定，结果表明，所有菌株对氨苄西林、米诺环素和氯霉素表现敏感，而对阿米卡星、氨曲南、苯唑西林、万古霉素和左氧氟沙星等几种抗生素表现耐药，这可能与鱼类的生活习性、食物链及鱼类生活的水体环境被污染等原因有关，也可能是部分菌株本身存在天然耐药性[35]。后续将会对更多低温肉杆菌的产细菌素特性及耐药基因进行更深入研究，以期为低温肉杆菌作为益生素在鱼类饲料添加剂方面的应用提供科学依据，为食品防腐保鲜技术及肉杆菌的安全性评估提供一定的参考依据。