冷藏草鱼源气单胞菌的群体感应现象及其对生物膜形成的影响

张彩丽，王辰晨，朱菲菲，刘海梅，刘岩龙*

（鲁东大学食品工程学院，山东 烟台 264025）

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肉质鲜嫩、营养丰富，深受消费者的喜爱，是我国淡水养殖产量最高的鱼类，2017年产量高达534.56万 t[1]。水产品在贮藏、运输以及销售过程中，常常由于几种微生物的活动而导致腐败变质，这些微生物被称为特定腐败菌，是引起水产品腐败的关键因素[2]。已有研究显示气单胞菌是冷藏草鱼的特定腐败菌，草鱼在4 ℃贮藏8 d时，气单胞菌数量达到8.49（lg（CFU/g）），占细菌比例的48.76%[3]。气单胞菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性菌，最低生长温度为0～5 ℃，可以在低温条件下与其他嗜冷菌竞争，因此在冷藏水产品中常常检出，鱼类水产品中气单胞菌的污染率达31.9%[4]。

细菌在生长繁殖过程中会产生一类被称为自诱导物的信号分子。随着细菌密度的增加，信号分子浓度也随之增加，当达到一定阈值时，便会启动某些基因的表达调控细菌的生理活动，从而表现出一定的群体行为，这种现象称为群体感应[5]。很多研究显示群体感应调控细菌的生理性状，如胞外酶的分泌、毒力因子的表达等[6]。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones，AHLs）是革兰氏阴性菌中广泛存在的最典型群体感应信号分子，其分子结构由一个高丝氨酸内酯环和酰基侧链组成，因酰基侧链取代基（—H、—OH、＝O等）不同、碳链长度或不饱和度的不同而存在差异[7]。

生物膜是微生物聚集在一起形成的特殊细菌群落，它增强了细菌抵抗外界环境的能力。生物膜一旦形成，便很难清除，这为食品的贮运和保藏带来很大的风险，也是影响食品工业卫生安全的一个重要指标[8]。研究显示细菌的群体感应现象可以影响生物膜的形成[9]，群体感应抑制剂可以有效地抑制细菌的生物膜形成[10]。

本研究以冷藏草鱼的优势腐败菌气单胞菌为对象，探究其群体感应现象以及生物膜的形成情况，评价群体感应对气单胞菌生物膜形成的影响，旨在为冷藏草鱼的保鲜贮运提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白胨大豆肉汤（trypticase soy broth，TSB）、Luria-Bertani（LB）肉汤、LB琼脂、生理生化实验试剂盒青岛海博生物技术有限公司；结晶紫、乙醇 国药集团化学试剂有限公司；N-丁酰基高丝氨酸内酯（N-butanoyl-L-homoserinelactone，C4-HSL）、N-己酰基高丝氨酸内酯（N-hexanoyl-L-homoserinelactone，C6-HSL） 上海甄准生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×EasyTaq PCR Supermix 全式金生物技术有限公司；RP-18 F254S反相C18-薄层色谱板 德国Merck公司。

1.2 仪器与设备

SHP-250生化培养箱 上海培因实验仪器有限公司；HY-60振荡摇床 武汉汇诚生物科技有限公司；LDZX-40II型高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械公司；SWCJ-2FD 超净工作台 上海博迅实业有限公司；UV-1300型紫外-可见分光光度计 上海美析仪器有限公司；Tanon-5200凝胶成像系统 上海天能科技有限公司；KH19A高速离心机 湖南凯达科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离

冷藏草鱼贮藏8 d（货架期终点），随机取出2 尾，无菌条件下取腹部鱼肉25 g，参照Wang Guangyu等[11]的方法分离气单胞菌。挑取菌落数在30～300 CFU的平板，对单菌落进行纯化并保存。纯化的菌株以W1、W2、W3……进行命名。

1.3.2 细菌的鉴定

利用全式金细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，然后扩增细菌的16S rRNA序列[12]，将聚合酶链式反应产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送往生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果利用NCBI数据库进行比对。

将分离的气单胞菌属细菌进行氧化酶、氨基酸、糖类利用、七叶苷等生理生化实验，在细菌种水平上进一步鉴定。

1.3.3 AHLs活性检测

平板划线法：将待检测菌株与报告菌株CV026在LB平板上平行划线，28 ℃培养18～24 h，观察颜色变化[13]。

报告平板法：利用报告平板法检测细菌生长过程中的AHLs活性变化。过夜活化的菌株W41和W69接种于LB肉汤，每隔4 h取10 mL菌液，12 000 r/min离心10 min后，获得细菌上清液，将细菌上清液经0.22 μm微膜过滤除菌后，于-20 ℃保存备用。取过夜培养至对数期的紫色杆菌CV026 2～3 mL，加入冷却至40 ℃的含1.5%琼脂的LB中，混匀后倾倒平板。待平板凝固后，用无菌打孔器在琼脂中央打孔，加入50 μL不同培养时间的细菌上清，于28 ℃培养24～48 h，用游标卡尺量取紫色区域直径，直径越大表明AHLs浓度越高[14]。

1.3.4 AHLs提取

参考文献[15]的方法，取培养至对数期的菌液100 mL，于10 000 r/min离心10 min，收集上清液，取50 mL细菌上清液用等体积乙酸乙酯（0.5%甲酸酸化）萃取3 次，合并有机相，旋蒸、溶解，保存至-20 ℃。

1.3.5 AHLs鉴定

反相薄层层析法[16]：利用C18-反相薄层层板，将标准品AHLs与乙酸乙酯提取物2～5 μL点样于反相薄层层析板，利用甲醇-水（60∶40，V/V）充分展开，取出后在常温下挥干溶剂，按制备报告平板方法制备含CV026菌液的LB琼脂，倾到于薄层层析板上，凝固后，28 ℃培养18～24 h，根据迁移值比对信号分子类型。

气相色谱-质谱法[17]：将乙酸乙酯提取的AHLs利用气相色谱-质谱进一步鉴定，使用6890 N气相色谱结合5973质谱仪，HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），升温程序：初始温度150 ℃保持3 min，以25 ℃/min升至280 ℃；氦气作为载气，流速0.8 mL/min；进样量1 μL；不分流模式。质谱条件：电子电离源，电子能量70 eV，传输线温度280 ℃，离子源温度230 ℃，激活电压1.5 V，选择性扫描模式m/z143。

1.3.6 生长曲线测定

将待测细菌分别在LB琼脂活化后，挑取单菌落接种在LB肉汤中，过夜培养后，按1%比例接种在100 mL新鲜LB肉汤中，120 r/min、30 ℃振荡培养，0、4、8、12、16、20 h和24 h后在无菌环境下取出菌液10 mL，于600 nm波长处测定OD值，每个实验重复3 次。

1.3.7 生物膜形成测定

参考Peeters等[18]的方法利用结晶紫染色法测定细菌的生物膜形成量。将过夜培养的细菌按1%比例接种在48 孔细胞培养板中（装液量1 mL TSB），30 ℃静置培养36 h。小心吸除菌悬液，用蒸馏水清洗每个孔3 次，然后用0.1 g/100 mL的结晶紫染色15 min，再用蒸馏水清洗每个孔3 次后，加入95%乙醇溶液脱色5 min，混匀后于590 nm波长处测定吸光度，以无菌的TSB肉汤作为空白组。每个实验重复3 次。

不同温度生物膜测定：将过夜培养的细菌按1%比例接种于LB肉汤中，然后加入48 孔细胞培养板中，分别置于8、30 ℃和37 ℃培养36 h，参考上述结晶紫方法测定生物膜形成量。每个实验重复3 次。

外源C4-HSL、C6-HSL对生物膜影响：将过夜培养的细菌按1%比例接种于LB肉汤中，然后加入48 孔细胞培养板中，分别加入终浓度为2、5、10、20、50 μmol/L的外源C4-HSL或C6-HSL（C4-HSL和C6-HSL溶解于二甲基亚砜），以添加二甲基亚砜组作为对照，30 ℃静置培养36 h，参考上述结晶紫方法测定细菌的生物膜形成量。每个实验重复3 次。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 细菌的鉴定

利用分子生物学方法，对20 株细菌进行16S rRNA扩增，获得的序列经NCBI数据库进行BLAST比对，结果显示均为气单胞菌属（Aeromonas）。生理生化实验结果（表1）显示，本研究分离的气单胞菌氧化酶反应均为阳性，均不能利用鸟氨酸和阿拉伯糖，而均具有利用葡萄糖产酸的能力，但是相同种水平的细菌在精氨酸、赖氨酸、七叶苷、水杨苷等的利用上存在差异。Abbott等[19]的研究也显示气单胞菌属在种水平的鉴定比较困难，传统的生理生化反应多有重叠，很难明确区分，而且鉴定的实验方法也不一致。结合16S rRNA结果，本研究分离的气单胞菌属包括杀鲑气单胞菌（A. salmonicida，7 株）、嗜水气单胞菌（A. hydrophila，5 株）、中间气单胞菌（A. media，3 株）、A. rivuli（3 株）和A. molluscorum（2 株），其中嗜水气单胞菌包含多个亚种。

表1 气单胞菌鉴定结果Table 1 Identification of the isolated Aeromonas spp.

2.2 AHLs检测结果

报告菌株平板划线法是定性检测细菌产AHLs能力的最直接最快速的方法，Chromobacterium violaceumCV026是常用的报告菌株之一。C. violaceum CV026本身不产AHLs，但具有感受AHLs的蛋白CivR，当感受到外界AHLs，可产生肉眼可见的紫色。如图1所示，冷藏草鱼中分离的20 株菌中，有18 株气单胞菌可诱导CV026发生颜色反应，只有菌株W72、W85不产生AHLs。

图1 利用报告菌株C. violaceum CV026平行划线检测细菌AHLs活性Fig. 1 Detection of AHLs production in Aeromonas spp. strain suspensions cross fed with biosensor C. violaceum CV026

2.3 生物膜检测结果

利用结晶紫染色法半定量检测气单胞菌的生物膜形成情况，因为葡萄糖促进细菌生物膜的形成，所以在初步检测细菌的生物膜形成能力时，采用含有葡萄糖的TSB肉汤进行培养。参考Stepanovic等[20]的方法，将空白孔A590nm值的3 倍标准差作为临界cut-off值，根据A590nm值将细菌分为以下几类：A590nm≤0.20，弱生物膜形成能力；0.20＜A590nm≤0.80，中等生物膜形成能力；A590nm＞0.80，强生物膜形成能力。如图2所示，20 株气单胞菌属中，有13 株为弱生物膜形成能力，5 株为中等生物膜形成能力（W51、W56、W65、W69、W70），2 株为强生物膜形成能力（W41、W77）。其中菌株W41的生物膜形成能力最强，A590nm达3.049±0.07。本研究将选取2 株产AHLs的细菌为代表，进一步研究AHLs对气单胞菌生物膜形成能力的影响。为减少细菌的种间差异，选取相同种水平的生物膜形成能力不同的2 株细菌，因此选取A. salmonicida W41和A. salmonicida W69作后续研究。

图2 20 株气单胞菌生物膜形成能力的定量检测结果Fig. 2 Biofilm formation ability of 20 isolates determined using the quantitative adhesion test

2.4 细菌生长曲线及AHLs产生规律

将细菌W41和W69接种在LB肉汤中，测定其生长曲线和AHLs产生规律。如图3A所示，2 株菌在最适生长温度（30 ℃）下适应环境能力和生长繁殖速度很快，培养4 h后即进入对数期，24 h时细菌W41和W69的密度（OD600nm）分别达2.12±0.06和1.80±0.01，菌株W41的生长速率始终显著快于W69（P＜0.05）。2 株菌产AHLs规律分别如图3B、C所示，紫色圆圈直径越大表示AHLs活性越高，从4 h开始菌株W41（OD600nm为0.31±0.02）和W69（OD600nm为0.08±0.01）便有可检测的AHLs产生，且随着细菌密度的增加AHLs活性增加。W41的AHLs活性从4 h开始维持较高水平，在20 h活性有所下降；菌株W69的AHLs活性在8 h达到最高，从12 h稍有下降后便维持在稳定水平。在细菌培养过程中，AHLs活性一般都呈现先上升后下降的趋势，对虾源不动杆菌Acinetobacter spp. M1的AHLs分泌也有相似的现象，Acinetobacter spp. M1中AHLs活性在0～24 h随细菌密度的增加呈现逐渐增长的趋势，在24 h对数末期达到最大值，然后开始下降，其主要原因是细菌生长到达稳定期时，细菌产生的次级代谢产物导致呈碱性环境，而AHLs在碱性环境中不稳定[21]。该现象在Vibrio anguillarum、Hafnia alvei等细菌的AHLs活性规律检测中都有发现[22-23]。

图3 菌株生长曲线（A）及 W41（B）、W69（C）的AHLs分泌规律Fig. 3 Growth curves (A) and AHLs activity of strains W41 (B) and W69 (C) during incubation

2.5 AHLs类型鉴定

利用薄层色谱法检测气单胞菌W41和W69产生的AHLs类型，结果如图4所示，2 株气单胞菌均可产生C4-HSL和C6-HSL，且C4-HSL活性高于C6-HSL。气相色谱-质谱进一步鉴定如图5所示，气单胞菌A. salmonicida W41和A. salmonicida W69主要产生C4-HSL和C6-HSL类型信号分子。Gui Meng等[24]从真空包装冷藏鲟鱼的特定腐败菌A. veronii LP-11中检测到C6-SHL、C8-HSL、3-oxo-C8-HSL和3-OH-C8-HSL四种AHLs。Nagar等[25]检测了22 株不同食品源气单胞菌产生的AHLs类型，其中18 株可以产生C4-HSL，18 株可以产生C6-HSL，另外某些气单胞菌还可以产生奇数链的AHLs（如C5-HSL、C7-HSL），由此可以看出，C4-HSL和C6-HSL是气单胞菌属产生的典型AHLs。细菌AHLs产生差异可能与细菌的种水平以及生存环境有关。

图4 薄层色谱法检测气单胞菌W41和W69的AHLs活性Fig. 4 AHL profile of strains W41 and W69 detected by thin-layer chromatography with C. violaceum CV026

图5 气相色谱-质谱检测菌株W41和W69提取液中的AHLs类型Fig. 5 Gas chromatography-mass spectrometry analysis of AHLs extracted from culture supernatants of strains W41 and W69

2.6 温度对气单胞菌生物膜形成影响

将2 株菌W41和W69接种在LB肉汤中，测定不同温度下培养36 h的生物膜形成量，选取的3 个温度为8、30、37 ℃分别为食品冷链温度、细菌最适生长温度和最高生长温度。如图6所示，2 株菌在8 ℃的生物膜形成量没有显著差异，而在30 ℃时W41的生物膜形成量显著高于W69（P＜0.05）。细菌W41的生物膜形成量从高到低分别为30 ℃＞8 ℃＞37 ℃；细菌W69的生物膜形成量从高到低分别为8 ℃＞30 ℃＞37 ℃。由此看出，细菌生物膜的形成受多种因素的影响，细菌个体间也存在较大差距，温度因素也是影响生物膜形成的重要因素。海洋源弧菌V. alginolyticus的生物膜形成能力为16 ℃＞28 ℃＞40 ℃，且不同个体间鳗弧菌的生物膜形成能力也存在较大差异[26]。

图6 不同温度下菌株W41和W69的生物膜形成量Fig. 6 Biofilm formation of strains W41 and W69 at different temperatures

2.7 AHLs对气单胞菌生物膜形成的影响

图7 C4-HSL（A）和C6-HSL（B）浓度对菌株W41和W69生物膜形成能力的影响Fig. 7 Biofilm formation of strains W41 and W69 upon supplementation with exogenous C4-HSL (A) and C6-HSL (B) at 30 ℃

许多研究显示细菌的生物膜形成受群体感应的调控，通过外源添加不同浓度的C4-HSL和C6-HSL，探究外源AHLs对气单胞菌生物膜的影响。如图7所示，C4-HSL对菌株W41的生物膜形成没有影响，50 μmol/L C6-HSL显著促进了菌株W41生物膜的形成（P＜0.05）。而对于菌株W69，低浓度的AHLs促进W69生物膜的形成，高浓度的AHLs抑制其生物膜的形成；1～10 μmol/L C4-HSL促进了W69生物膜的形成，50 μmol/L C4-HSL抑制了W69生物膜的形成；类似地，10 μmol/L C6-HSL显著促进W69生物膜的形成（P＜0.05），20 μmol/L浓度C6-HSL对菌株W69生物膜的形成显示抑制作用。该现象在蜂房哈夫尼菌（H. alvei）中也有体现，Hou Hongman等[23]的研究显示低浓度（5、10 μmol/L）的C6-HSL促进H. alvei生物膜形成，而高浓度的（20、40 μmol/L）的C6-HSL抑制H. alvei生物膜形成，而C4-HSL和3-oxo-C8-HSL的作用效果则与C6-HSL相反。Zhao Dandan等[27]的研究结果表明0.5 mmol/L C4-HSL、C6-HSL、C7-HSL和C8-HSL对鱼糜中的A. veronii均显示促进效果。Li Tingting等[28]的研究结果显示外源添加的C4-HSL、C6-HSL和C10-HSL不同程度地促进了冷藏大菱鲆源假单胞菌属P. fluorescens生物膜的形成，其中以C6-HSL的促进效果最为显著。由此可以看出，细菌对群体感应信号分子的感受能力存在较大的个体差异，细菌对AHLs类型以及浓度具有一定依赖性。

3 结 论

本研究检测了冷藏草鱼源分离获得的20 株气单胞菌Aeromonas spp.的群体感应现象和生物膜形成情况，有18 株气单胞菌可以产生AHLs信号分子，20 株菌均显示有不同强弱程度的生物膜形成能力。以生物膜形成能力较强的2 株菌A. salmonia W41和A. salmonia W69为主要对象，结果表明2 株菌的AHLs活性具有菌体密度依赖性，该2 株菌主要产生C4-HSL和C6-HSL信号分子，AHLs对细菌的生物膜形成能力影响不同，其中高浓度C6-HSL促进A. salmonia W41生物膜的形成；而高浓度AHLs降低了A. salmonia W69的生物膜形成，低浓度AHLs促进A. salmonia W69生物膜的形成。本研究显示大多数草鱼源气单胞菌可以产生群体感应信号分子，并且AHLs可以影响气单胞菌生物膜的形成情况，为水产品保鲜剂的开发提供一定的理论支持。