高效液相色谱-串联质谱法同时测定番茄中的番茄苷与番茄碱

张新娜，潘赛超，张旭冬，张秀杰，张永新，周 昉，张春娇，黄昆仑,3，马丽艳,3,*

（1.农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（北京），北京 100083；2.农业农村部科技发展中心，北京 100045；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

糖苷生物碱是植物体内的次生代谢产物，主要分布于茄科和百合科的植物体内[1]。番茄是茄科番茄属草本植物，番茄苷和番茄碱是番茄化合物中重要的生物活性因子[2]。番茄苷，又名番茄素或番茄苷，是一种含有D-木糖、D-半乳糖及两分子葡萄糖的糖苷生物碱[3]，番茄碱是番茄苷水解脱糖后形成的糖苷元，其生物活性比番茄苷低[4-5]。番茄苷能够保护番茄植株在生长过程中免受细菌、真菌、病毒和某些昆虫的侵害[6-7]，对很多害虫都有驱拒性，是一种天然的植物源杀虫剂[8-9]。研究表明，番茄苷具有抗炎[10-11]、抗癌功效[12-13]，对乳腺癌[14]、前列腺癌[15]、结肠癌[16]、肝癌和肺癌[17]等有一定的治疗效果。然而，作为一种甾体生物碱，番茄苷会造成小鼠胚胎畸形或颅面畸形等[18-21]，对人的胃肠道也有刺激作用，具有一定的神经毒性[22-23]，大量食用后会出现头晕、恶心、呕吐和乏力等症状。

番茄中生物碱的检测方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、免疫测定法、高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法等。利用HPLC法进行分析时，可采用紫外检测器、脉冲安培检测器，示差检测器等进行测定[24-28]。紫外检测器易受到其他物质的干扰，检出限高于脉冲安培检测器。利用GC-MS法进行分析时，不能对番茄苷直接进行测量，而是要先将其水解成相应的糖苷并衍生后才能进行测量，增加了操作的复杂性[4,29]。免疫测定法需要检测样品有相当高的纯度，Barbour等[30]用免疫测定法测定番茄苷时发现，该方法对于分析糖苷生物碱呈现的是一种非线性关系。此外分光光度检测法[31]、放射配体检测法[32]也可用于番茄苷的检测。分光光度检测法容易受到提取物中杂质和有色物的影响，放射配体检测法不需要对沉淀物进行纯化，能够检测出溶液中与胆固醇相结合的番茄苷的含量[33]。HPLC-MS/MS具有高选择性和灵敏度，在番茄碱的分析中应用越来越广泛，目前对番茄苷的检测多采用选择离子监测的模式[34-36]，番茄苷和番茄碱同时测定的报道较少。

目前，对番茄中番茄碱的含量测定的报道较少，有研究表明番茄在成熟过程中，番茄苷的含量逐渐降低，正常成熟的番茄中番茄碱的含量较低，一般不会引起中毒[4]。但在番茄生产、销售过程中，部分生产者为了方便运输，会提前采收，利用药物对番茄进行催熟，尤其是在反季节上市的番茄，这种现象更为普遍。为监测番茄中番茄碱的含量水平，保护消费者身体健康，迫切需要建立番茄中番茄苷和番茄碱的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（均色谱纯），冰乙酸、乙酸铵（均为分析纯），番茄碱（C27H45NO2，CAS号：77-59-8，纯度98%）、番茄苷（C50H83NO21，CAS号：17406-45-0，纯度98%） 北京百灵威科技有限公司；C18固相萃取柱（500 mg，6 mL） 安捷伦科技（中国）有限公司；超纯水由Millpore纯水仪制备。

1.2 仪器与设备

6460型HPLC-MS/MS仪、固相萃取装置 美国安捷伦科技有限公司；IKA T25高速匀浆机 北京德泉兴业商贸有限公司；VORTEX-5涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；YP5002电子天平 上海越平科学仪器有限公司；HC-3018离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

番茄采自北京昌平蔬菜生产基地，样品制成匀浆后，-18 ℃冰箱保存。

1.3.2 提取

称取番茄样品5.00 g置于烧杯中，加入10%乙酸溶液20.0 mL，匀浆提取2 min，转移至离心管中，8 000 r/min离心5 min，上清液用提取液定容至25 mL，待净化。

1.3.3 净化

采用C18固相萃取柱净化。先用5 mL甲醇活化，5 mL 10%乙酸溶液平衡，准确吸取5 mL上清液上柱，5 mL 15%甲醇溶液淋洗，抽干2 min，用5 mL含1%甲酸的90%甲醇溶液洗脱。洗脱液用水稀释1 倍后过0.22 μm微孔滤膜，上机检测。

1.3.4 液相色谱条件

色谱柱：Proshell 120 EC-C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量3 µL；流动相A为5 mmol/L乙酸铵（含0.05%甲酸）溶液；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：30% B保持2 min，5 min后变为80% B，6 min后变为30% A，保持7 min。

1.3.5 质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源，正模式；毛细管电压3 500 V；干燥气流速10 mL/min；干燥气温度350 ℃；雾化器压力35 psi；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 mL/min。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别在正、负离子模式下对番茄碱和番茄苷标准溶液进行母离子扫描，设置扫描范围在300～1 200 u之间，结果表明2 种化合物均在正离子模式下响应较高。确定母离子和扫描模式后，对鞘气温度、干燥气温度、碎裂电压、子离子及碰撞能量进行优化。结果表明干燥气温度对2 种化合物的响应无明显影响，而随着鞘气温度的升高，番茄苷的响应有明显的提高。通过优化，方法设置干燥气温度为350 ℃，鞘气温度为400 ℃。

番茄苷的相对分子质量为1 033，相对较大，虽然采用离子扫描的方式能对番茄苷的含量进行分析[36]，但参照2002/657/EC中的相关规定，利用HPLC-MS/MS进行确证时需提供一个母离子，2 个子离子的信息。实验经过优化，确定了番茄苷和番茄碱的多反应监测参数，见表1。

表1 番茄碱和番茄苷多反应监测参数Table 1 Multiple reaction monitoring parameters of tomatine and tomatidine

2.2 色谱条件优化

2.2.1 流动相组成优化

实验分别比较了0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液、0.1%乙酸-乙腈溶液、5 mmol/L乙酸铵-乙腈溶液、5 mmol/L甲酸铵-乙腈溶液组成的流动相体系对番茄苷和番茄碱分离效果及响应值的影响，结果表明不同流动相组成体系均能将2 种化合物进行分离，乙腈的流动相体系响应值高于甲醇体系，甲酸优于乙酸，乙酸铵优于甲酸铵。添加铵盐后，2 种化合物的保留时间有不同程度的延长。优化结果表明甲酸对番茄苷的响应值有抑制作用，乙酸铵对番茄苷的响应有明显增强作用；而使用乙酸铵后番茄碱的响应值和重复性变差。考虑到同时检测番茄中2 种主要的生物碱，实验采用乙酸铵-乙腈体系，并在5 mmol/L乙酸铵溶液中加入了0.05%的甲酸，番茄苷和番茄碱即能良好的分离，也有较高的灵敏度和重复性。

2.2.2 色谱柱选择

图1 标准溶液中番茄苷和番茄碱总离子流图和提取离子色谱图Fig. 1 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine standards

分别比较Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）、Poroshell 120 C18（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）和SB C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）3 种不同型号的色谱柱对番茄苷和番茄碱分离效果及响应值的影响，结果表明Poroshell 120 C18色谱柱的分离效果和响应值最好，其次是SB C18色谱柱，实验最终选择Poroshell 120 C18色谱柱。结果如图1、2所示。

图2 样品提取液中番茄苷和番茄碱总离子流图和离子提取色谱图Fig. 2 Total ion current and extracted ion chromatograms of tomatine and tomatidine in tomato extract

2.3 提取方法优化

2.3.1 提取溶剂优化

图3 提取溶剂对番茄苷和番茄碱的提取效果Fig. 3 Effect of extraction solvents on the recovery of tomatine and tomatidine

参考已有相关文献报道[24,27,29,34]，实验采用1%乙酸溶液、5%乙酸溶液、10%乙酸溶液、85%乙醇溶液及100%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶5（g/mL），超声提取2 次，每次30 min。以乙酸溶液为提取溶剂直接进行净化处理，含有机溶剂的提取液去除有机溶剂后进行净化。

从图3可以看出，从1%乙酸溶液到10%乙酸溶液提取时，番茄苷含量无明显差异，但番茄碱含量随着乙酸溶液体积分数的增加，提取效率有增加。以100%乙醇为提取溶剂的提取效果低于85%乙醇溶液的提取效果。虽然85%乙醇溶液与10%乙酸溶液的提取效果无明显差异，也有良好的提取效果，但该方法适合于番茄碱粗提物的提取制备[34,36]，对番茄样品中番茄苷、番茄碱含量进行分析时需要去除大量有机溶剂后才能进行净化处理，增加了分析的步骤，实验最终选择10%乙酸溶液作为提取溶剂。

2.3.2 提取方式优化

实验以10%乙酸溶液为提取剂，料液比1∶10，分别比较超声、搅拌和匀浆3 种提取方式的提取效果，其中超声提取的时间为30 min[36]，搅拌提取时间为2 h[27]，匀浆提取时间为3 min，结果见图4。

图4 提取方式对提取效果的影响Fig. 4 Effect of extraction methods on the recovery of tomatine and tomatidine

目前番茄中生物碱的提取方式多采用超声提取法[29,36]，但从图4可以看出，3 种提取方式中，超声的提取效果最差。搅拌提取[27]虽然与匀浆提取无明显差异，但提取时间相对较长，实验最终选择匀浆提取方式。

2.3.3 提取时间、料液比优化

实验以匀浆提取方式，分别比较了匀浆1、2 min和3 min的提取效果，结果发现三者无明显差异，为保障提取完全，实验选择匀浆提取时间为2 min。实验比较了料液比为1∶3、1∶4、1∶10（g/mL）的提取效果，结果发现三者无明显差异，考虑操作方便性和溶剂的消耗情况，实验选择料液比为1∶4。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性范围

将番茄苷配制成质量浓度为50、100、250、500 ng/mL和1 000 ng/mL标准工作溶液，番茄碱配制成质量浓度为5、10、25、50、100 ng/mL标准工作溶液，按已建立测定条件进行分析，以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标绘制标准曲线。番茄苷的线性方程为y=422.37x＋9 905.6，相关系数为0.999 1；番茄碱的线性方程为y=66 213x-113 318，相关系数为0.999 4，2 种化合物线性方程良好，相关系数均大于0.99，满足定性检测方法的要求。

2.4.2 方法的准确度和精密度结果

方法的准确度采用添加回收实验进行。分别向番茄样品中添加番茄碱及番茄苷标准溶液，使番茄苷的添加量分别为5.00、10.0 mg/kg和20.0 mg/kg，番茄碱的添加量分别为50、100 μg/kg和200 μg/kg，按建立的方法进行提取、净化和分析，添加回收率和精密度结果见表2。

表2 添加回收测定结果（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of tomatine and tomatidine (n= 6)

从表2可以看出，番茄苷回收率在86.0%～92.0%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）在2.3%～6.8%之间；番茄碱添加回收率在85.6%～105%之间，RSD在1.0%～6.1%之间，能满足测定的需要。以10 倍信噪比计算，番茄苷的检出限为1.0 μg/kg，番茄碱的检出限为0.10 μg/kg。

2.4.3 基质效应评价

分别用溶剂和番茄基质配制相同质量浓度的标准工作液，进行色谱-质谱分析，计算基质效应。基质效应/%=（基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1）×100[37]。利用HPLC-MS/MS进行分析时，由于有共流出组分的存在，会影响离子化效率，当基质效应为-20.0%～20.0%、-50.0%～-20.0%和20.0%～50.0%、小于-50.0%和大于50.0%时，分别表示轻微、中等、较强的基质效应[38]。可以通过改善色谱分离条件、对样品进行净化、基质配制标准曲线等方式减少基质对分析的影响。本实验出现结果表明，番茄苷的基质效应为4.5%，番茄碱的基质效应为2.8%，均小于20%，基质效应较弱，因此可以用溶剂配制标准溶液进行样品的定量分析。

2.5 样品测定

2.5.1 样品含量测定

采用本实验建立的方法，对来自北京昌平番茄生产基地的样品进行检测，部分样品检测结果见表3。

表3 番茄样品检测结果Table 3 Contents of tomatine and tomatidine in tomatoes determined by the developed method

从表3可以看出，大番茄中番茄苷含量在6.06～37.54 mg/kg之间，番茄碱含量在0.18～25.54 μg/kg之间；樱桃番茄中番茄苷含量在0.11～35.58 mg/kg之间，番茄碱含量在0.13～9.86 μg/kg之间。无论是大番茄还是樱桃番茄中番茄苷的含量均明显高于番茄碱，表明番茄生物碱主要是以糖苷生物碱的形式存在。番茄苷的生物活性高于番茄碱[4-5]，研究番茄中番茄苷的含量变化对保障食用安全有重要的意义。

2.5.2 成熟过程中番茄苷含量变化

选择3 个不同品种的番茄，研究其在青熟期、转色期、半熟期和完熟期等不同生长过程中番茄苷含量的变化规律。由图5可以看出，3 个品种的番茄：寿研、浙粉、红宝石在成熟过程中均呈现出下降趋势，青熟期到半熟期下降速度较快，半熟期后下降趋于平缓，这与陶永霞等[24]报道一致。

图5 番茄生长过程中番茄苷含量的变化Fig. 5 Changes of tomatine content during tomato growth

3 结 论

利用HPLC-MS/MS建立番茄中番茄苷和番茄碱的同时检测方法。该方法简单、快速、灵敏度高、重复性好，可满足番茄中番茄苷与番茄碱的定性、定量分析。检测结果表明，番茄中番茄苷的含量明显高于番茄碱，番茄苷在成熟过程中呈下降趋势，完熟后含量较低。