超高效液相色谱-串联质谱法测定圆椒中甘油磷脂含量

何秀梅，藏志焕，陈 晴，赵瑛博*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

圆椒，又名川菜椒（Capsicum annuum var.grossum），俗称灯笼椒、柿子椒，是茄科辣椒属辣椒的一个变种。圆椒在农业生产中属于大宗蔬菜品种，在我国的生产和消费量都十分巨大[1]。对于圆椒的贮藏保鲜方法通常是低温贮藏，但随着贮藏时间的延长和温度的降低，圆椒会出现一系列的冷害现象[2-3]，例如表皮全部或局部出现水渍样凹陷斑，表皮颜色转为深绿，进而腐烂，完全失去商品属性。研究表明，这些冷害现象的出现与细胞膜脂代谢紊乱有重大关联。在发生冷害时，细胞膜由液晶态转变为凝胶态，膜间隙变大，流动性降低，透性升高，而影响到细胞膜功能。膜脂的种类、含量以及不饱和度的高低影响着膜脂的相变，其中含量最高的是磷脂，其他还有糖脂、甘油脂等，这些脂类在各代谢网络中可以相互转化，彼此关联[4]。因此，监测冷藏过程中圆椒细胞膜磷脂种类和含量的变化对于评估圆椒冷害发生的程度以及提出调控冷害发生的有效方法具有重要意义。

甘油磷脂是最重要的磷脂，是亲水脂两性分子。甘油主链的第3个羟基被磷酸酯化，磷酸基团又与各种结构不同的小分子化合物相连接，而具有极性，成为极性头部。另外2 个羟基被脂肪酸酯化，具有非极性特性，成为非极性尾部。根据磷酸基连接的小分子种类的不同，甘油磷脂可以分为磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylamide ethanolamine，PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidyl amide serine，PS）、磷脂酰甘油酸（phosphatidyl amide glycerol，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）及磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）等；如果甘油主链sn-2位未被取代，则得到溶血磷脂，包括溶血磷脂胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂乙醇胺（lysophosphatidylamide ethanolamine，LPE）、溶血磷脂丝氨酸（lysophosphatidyl amide serine，LPS）、溶血磷脂甘油（lysophosphatidylglycerol，LPG）、溶血磷脂肌醇（lysophosphatidylinositol，LPI）、溶血磷脂酸（lysophosphatidyl amide glycerol，LPA）等[5-6]。在每一类磷脂中又可因组成的脂肪酸不同而有若干种，因此甘油磷脂的种类繁多。这为磷脂分子的定性定量分析带来一定困难，因此需要采用可靠的手段确认磷脂的种类，并采用相对定量的方法为每种磷脂定量。

磷脂成分的分离和鉴别有多种方法，例如液相色谱-蒸发光散射、电喷雾-串联质谱法[7]、二维液相色谱-串联质谱法[8]、超高效液相色谱-串联质谱[9]（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）等。在这些方法中，由于具有更高的柱效和更强的定性能力，UPLCMS/MS法可以使磷脂获得更佳的分离并能够方便的对其进行结构鉴定。分离的方式有正相分离和反相分离[10]，正相分离采用的流动相极性较低，与质谱的兼容性较差；磷脂在反相C8柱[11]或C18柱[12-13]的分离主要依靠支链碳数的差别，而在不同极性头部磷脂间的分离则较弱。近年来开发的HILIC色谱柱采用了极性改性的固定相，而增强了对强极性化合物的保留能力，Ma Xiaoxiao[14]和Ali[15]等使用HILIC色谱体系对磷脂成分进行分离，获得了较传统正相、反相系统更好的分离效果。在串联质谱法中应用于磷脂鉴别的主要为三重四极杆质谱[16-17]和四极杆-飞行时间质谱[12,15,18-22]两种。前者可以通过母离子扫描和中性丢失扫描等方式确定特征碎片，而后者则是通过测量精确分子质量和特征碎片对磷脂分子进行结构鉴定。

关于细胞膜磷脂的样品来源，既有植物样品也有动物样品。动物源样品包括组织[16,23-24]、血浆[11,18,25]、蛋类、奶等[15]；植物样品包括蔬菜[22]、水果、叶片、模式植物拟南芥等[26]。相对于动物样品，由于含有细胞壁，所以植物来源的磷脂成分的提取过程相对繁琐。液液萃取法通常用于动植物样品中磷脂的提取，采用的溶剂主要为甲醇-氯仿[11,12,27]以及甲醇[19-20]、异丙醇等。另外，Karin等[17]也采用固相萃取法提取磷脂。本实验将分别采取以上各方法分别提取圆椒中磷脂，并对提取出的磷脂种类和含量进行比较和评估，以优化提取方法。

本研究分别讨论以甲醇、异丙醇、异丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿为提取剂的液液萃取方法以及固相萃取法提取圆椒中的磷脂，通过比较各方法测出的磷脂种类和含量评估最优前处理方法。采用HILIC系统分离不同种类的磷脂，以三重四极杆质谱法鉴别其结构并用相对定量法定量。同时对方法的适应性进行评价，进而建立针对圆椒样品磷脂测定的UPLC-MS/MS方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

圆椒购自沈阳市当地菜市场。样品新鲜无机械损伤。取果肉部分切成0.5 cm×1.0 cm的小块，备用。

磷脂标准品：PA（C28:0）、LPS（C16:0）、LPC（C14:0）、LPE（C14:0） 美国Avanti Polar Lipids公司；PG（C28:0）、PC（C28:0） 美国Sigma-Aldrich公司。

甲醇、乙腈、甲酸铵（均为色谱纯） 美国Fisher Scientific公司。用于样品制备的其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

LC-20A型液相色谱系统、LCMS-8050型LC-MS联用仪（配有电喷雾离子源） 日本岛津公司；ACQUITY UPLC®BEH HILIC色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、Sep-Pak硅胶固相萃取柱（500 mg） 美国Waters公司；902超低温冰箱（-80 ℃） 美国Thermo公司；CR21N低温高速离心机 日本Hitachi公司；Cenco涡旋仪 荷兰Breda公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

为选择适合圆椒样品的磷脂提取方法，本实验对5 种经典的磷脂提取方法进行修改，并分别应用于圆椒磷脂的提取。为了表述方便，将这些方法依次命名为甲醇法、异丙醇法、异丙醇-氯仿-水法、BD（Bligh and Dyer）法和固相萃取法。具体的前处理过程如下：

甲醇法：称取约3 g样品，加入3 mL甲醇，涡旋1 min，离心。上清液旋转蒸发至近干，残渣用1 mL甲醇溶解，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜。

异丙醇法：称取约3 g青椒样品，加入3 mL异丙醇，涡旋1 min，离心。上清液旋转蒸发蒸至近干，残渣用1 mL甲醇溶解，涡旋1 min，过0.22 μm滤膜。

异丙醇-氯仿-水法：取3 g青椒样品，迅速置于75 ℃预热的3 mL异丙醇（含0.01%二丁基羟基甲苯（dibutylhydroxytoluene，BHT））中浸泡15 min，然后加入1.5 mL氯仿和0.6 mL超纯水，摇床中150×g避光振摇1 h。提取液转移到50 mL玻璃管中。残渣再用4 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V，含0.01% BHT）溶液抽提5 次，每次用摇床振摇30 min，直到样品变白。合并所有提取液，然后分别用1 mL 1 mol/L的KCl溶液和2 mL超纯水洗涤提取液。取有机相氮气吹干。残渣用1 mL流动相溶解，滤膜过滤。

BD法：取3 g样品置于30 mL玻璃管中，加入2 mL甲醇（含0.01% BHT）和4 mL氯仿，超声60 s后涡旋30 s，室温下静置10 h。向提取液中加入2 mL超纯水，4 ℃、2 600×g离心10 min。移除上层与中层溶液，底层溶液加入3 mL氯仿，氮气吹干。残渣以1 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜。

固相萃取（solid phase extraction，SPE）法：取3 g样品，加入2.5 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液及12.5 mL 1 mol/L的NaCl溶液，涡旋后静置分层，弃去上层溶液，下层氯仿层氮气吹干。残渣以1 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液溶解，得到样品溶液。以3 mL正己烷活化Waters Sep-Pak硅胶固相萃取柱。上样，分别加入3 mL正己烷-乙醚（8∶2，V/V）和3 mL正己烷-乙醚（1∶1，V/V）溶液淋洗，再用6 mL甲醇和2 mL氯仿-甲醇-水（3∶5∶2，V/V）溶液洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。1 mL甲醇溶解残渣，过0.22 μm滤膜。

因为磷脂种类众多，不同来源样品中磷脂种类也不尽相同，所以在对使用的5 种前处理方法进行选择时，根据每种方法能够检测到的磷脂种类、相应峰的峰面积作为考核指标，选择提取得到磷脂种类多且峰面积大的方法作为最优的前处理方法。

1.3.2 UPLC条件

处理后的样品用配有ACQUITY UPLC BEH HILIC色谱柱（2.1 mm×75 mm，2 μm）的液相色谱系统分离。流动相A为含有0.1%甲酸的50 mmol/L乙酸铵溶液（pH 3.18），流动相B为乙腈。使用梯度程序洗脱：0～6 min，95%～85% B；16 min，60% B；16.01～20 min，95% B，保持3 min；流速300 μL/min，总运行时间20 min。进样量1.0 μL，柱温40 ℃。

1.3.3 MS条件

电喷雾离子源，干燥气、雾化气为氮气，加热气为空气，干燥气流量10 L/min，雾化气流量3 L/min，干燥气流量10 L/min。离子源温度300 ℃，脱溶剂温度250 ℃，加热块温度400 ℃、喷雾电压±3 000 V。PC、LPE、LPC、LPS在正离子模式下测定，PA和PG在负离子模式下测定。各磷脂测定参数见表1。

表1 多反应监测参数Table 1 Mass spectral parameters in the MRM mode

1.3.4 方法适应性

为考察方法的灵敏度、准确度和精密度，进行加标回收实验。方法的灵敏度用检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）表示。分别测定质量浓度为125 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）基质溶液，测定信噪比，计算检出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。考虑到样品基质中可能含有的磷脂本底情况，添加的磷脂均为基质中不含有或含量极少。方法的准确度和精密度用方法回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）表示。向3 g样品中分别添加125、250 ng/mL和375 ng/mL三个水平的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的标准溶液1 mL，按上述方法进行前处理和UPLC-三重四极杆质谱方法测定。每个添加水平做6 个重复，计算方法回收率和RSD。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

利用不同种类磷脂极性头部的特征碎片进行中性丢失扫描或母离子扫描可以在一定程度上说明各前处理方法提取得到的磷脂种类，进而判断各前处理方法性能的优劣。各种类磷脂的特征碎片和扫描方式见表2。

表2 磷脂扫描方式及特征碎片Table 2 Scanning modes and characteristic fragments for phospholipids

利用母离子扫描和中性丢失扫描的方式分别对5 种前处理方法抽提得到的磷脂进行测定，检测到的磷脂数量和相关峰面积结果见表3。

表3 前处理方法的选择Table 3 Selection of pretreatment methods

在这5 种方法中，异丙醇法和异丙醇-氯仿-水法检测到的磷脂数目较多，但是在相关峰的峰面积比较中，异丙醇-氯仿-水法比异丙醇法多，且异丙醇法未能测得PS；其余3 种方法检测到的磷脂数目较少、峰面积较低，BD法未能测得PI和PE，SPE法未能测得PI。因此选择异丙醇-氯仿-水法作为提取磷脂的方法较为合适。

2.2 磷脂组分的分离

在HILIC体系中，流动相的pH值对组分的保留和选择性的影响相比反相体系更大。因此，在实验中分别使用pH 3.18、pH 4.45、pH 2.78的流动相B分析样品，最终确定在不同的pH值条件下，各磷脂的峰形、流出时间均有所不同。综合考察分离及流出情况，选择流动相B的pH值为3.18。

由于极性头部的不同，PG、LPI在仅负离子模式下有响应；PC、LPC只在正离子模式下有响应；LPS、LPE在正、负离子模式下均有响应，但在负离子模式下的响应更高，因此，PG、LPI、LPE、LPS在负离子模式下采集，PC、LPC在正离子模式下采集。各磷脂梯度洗脱顺序为PG＜LPI＜LPE＜PC＜LPC＜LPS。各组分总离子流图见图1。

图1 磷脂组分总离子流图Fig. 1 Total ion current chromatogram

2.3 磷脂的裂解规律

在外界有能量输入时，磷脂分子的化学键会发生断裂，产生若干二级碎片离子，这些离子反映磷脂分子的结构，因此这些碎片离子也被称为特征碎片。根据特征碎片可以判断与甘油骨架酯化的脂肪酸残基和极性头部，从而确认磷脂的分子结构。

分别将PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）进行碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID），使其中的化学键进行断裂和重排，获得其特征碎片，进而解释其裂解规律。由于磷脂分子结构的不同，不同种类的磷脂会分别在正离子模式或负离子模式下有更好地响应，在本实验中PC、LPC、LPE、LPS在正离子模式下响应更高，而PA、PG在负离子模式下响应更高。

图2 正离子模式下的PC（A）、LPC（B）、LPE（C）、LPS（D）的二级质谱图Fig. 2 Tandem mass spectra of PC (A), LPC (B), LPE (C), and LPS (D) in the positive ion mode

如图2A所示，母离子为[M＋H]＋，m/z 678，磷酸酯键被打断后产生PC（[C5H14O4NP＋H]＋）特征离子，m/z 184，该碎片离子为PC和溶血PC类分子的特征离子。其他的离子碎片m/z 495.4对应[M＋H-183]＋，m/z 211.2对应脱水肉豆蔻酸残基离子；m/z 285.2对应[M＋H-183-211]＋。在二级质谱图中无其他脂肪酸残基碎片，表明在甘油骨架sn-1和sn-2上都与肉豆蔻酸残基相连。

如图2B所示，LPC（C14:0）的二级质谱图与PC的裂解规律类似。m/z 468为母离子，对应[M＋H]＋，在CID模式下，磷酸酯键被打断，产生PC[C5H14O4NP＋H]＋和[C5H12N＋H]＋，对应m/z 184和m/z 86。m/z 285.2对应[M＋H-183-211]＋。

如图2C所示，母离子为[M＋H]＋，m/z 426，磷酸酯键被打断后出现PE的特征碎片[C2H7O4NP＋H]＋，m/z 141（未显示），离子碎片m/z 285.2对应[M＋H-140]＋。m/z 211.2为脱水肉豆蔻酸残基离子。在丢失肉豆蔻酸残基后，PE再继续裂解，中性丢失乙醇胺部分后的碎片对应为m/z 155.01。

如图2D所示，m/z 498为母离子[M＋H]＋，m/z 313.2对应LPS（C16:0）甘油骨架上sn-3位上磷酸酯键断裂后产生的碎片，即[M＋H-C3H7O6NP]＋；m/z 239.2对应脱水棕榈酸残基；m/z 155.01对应[M＋H-C16H29O-C3H7O3N]＋，即LPS（C16:0）丢失脱水肉豆蔻酸残基后中性丢失丝氨酸残基后的碎片。

图3 负离子模式下的PA（C28:0）（A）、PG（C28:0）（B）的二级质谱图Fig. 3 Tandem mass spectra of PA (C28:0) (A) and PG (C28:0) (B)in the negative ion mode

如图3A所示，m/z 591为PA（C28:0）的母离子[MH]-，m/z 363.2为磷脂酸sn-1位丢失肉豆蔻酸残基后产生的碎片；m/z 381为sn-1位丢失脱水肉豆蔻酸残基后产生的碎片；m/z 363.2碎片继续裂解，丢失sn-2位脱水肉豆蔻酸残基后得到m/z 153.0离子。图3A中响应值最高的m/z 227.2碎片为脱水肉豆蔻酸残基。

如图3B所示，m/z 665.4为PG（C28:0）的母离子[MH]-，m/z 455.2为PG分子丢失sn-1位脱水肉豆蔻酸残基产生的碎片；m/z 363.2碎片对应为m/z 455.2碎片上sn-3位甘油残基继续裂解丢失得到；然后该碎片上的sn-2位酯键继续断裂丢失脱水肉豆蔻酸残基，得到m/z 153.0碎片。m/z 227.2对应肉豆蔻酸残基。

通过对正、负离子模式下各类磷脂裂解规律的分析可以发现，在受到外界能量输入时，甘油骨架sn-3位上的磷酸酯键以及sn-1和sn-2位上的酯键更容易断裂，产生磷脂的极性头部和脂肪酸相关残基特征碎片，根据这些特征碎片可以为磷脂做定性分析。

2.4 方法适应性

2.4.1 方法的线性范围和灵敏度

为了避免基质效应，以圆椒样品提取溶液作为溶剂，分别配制质量浓度为10、50、100、500、1 000 ng/mL的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）的系列混合标准溶液。根据溶液质量浓度与峰面积的关系绘制标准曲线，并计算各磷脂的LOD和LOQ，结果见表4。

表4 磷脂的标准曲线、线性范围、LOD及LOQTable 4 Standard curves, linear ranges, limits of detection and limits of quantification

2.4.2 方法的准确度和精密度结果

表5 3 个添加水平的磷脂回收率与RSD（n=8）Table 5 Recoveries of phospholipids at three spiked levels and relative standard deviation (RSD) (n= 8)

由表5可知，6 种磷脂在3 个添加水平的平均回收率在68.06%～84.17%之间，RSD在3.40%～9.60%之间。参照农残分析实验方法验证标准（LOQ在0.01～0.1 mg/kg时，回收率在70%～120%之间，变异系数小于22%；LOQ在0.1～1.0 mg/kg时，回收率在70%～110%之间，变异系数小于18%），该方法基本满足要求。在各种磷脂中PC和LPC在各添加水平中回收率较高，RSD较小，可能是因为PC和LPC在质谱中的响应更高。

2.5 方法的应用

由于极性头部的不同和甘油骨架上酯化的脂肪酸残基种类众多，导致磷脂种类数量十分巨大，市场上的磷脂标准品种类十分有限且价格高昂，采用常规的标准品对照的方法鉴别磷脂分子显然不现实，因此在定性过程中，根据磷脂的保留时间和流出顺序以及得到的二级质谱碎片进行定性分析；同时，虽然不同磷脂在质谱中的响应不同，定量时也只能采用相对定量法进行。在HILIC体系中，各磷脂的分离主要依靠极性头部，定量时，向样品中分别加入一定量的PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）标准溶液，将其作为对照为具有相同极性头部的磷脂定量。同时将相同类别磷脂做归一化处理，用以表明各磷脂在同类磷脂中的比例。应用本实验建立的方法对圆椒样品进行测定，如表6所示。

表6 圆椒中磷脂种类及其相对含量Table 6 Types and relative contents of phospholipids in bell pepper determined by the developed method

由表6可知，圆椒样品中含有PC、PG、LPS、LPI、LPC、LPE。其中，共发现7 种PC、6 种LPE、7 种LPC、6 种LPS、6 种PG、6 种PA，共38 种磷脂。各磷脂的含量在0.95～18.49 μg/kg之间。在各种磷脂种类中，PC（C34:2）在PC中占比最高，达到31.18%；LPE（C16:0）和LPE（C18:1）在LPE中占比最高，分别达到28.91%和28.75%；LPC（C16:1）在LPC中占比最高，达到25.37%；在LPS中LPS（C16:3）占比35.55%，含量最高，是最主要的LPS；在PG中PG（C32:0）占比最高，达到23.89%；在PA中PA（C34:2）的含量最高，为29.83%。

4 结 论

本实验建立一种针对圆椒中磷脂含量测定的方法。分别对采用甲醇、异丙醇、异丙醇-氯仿-水、甲醇-氯仿为提取剂，使用液液萃取或固相萃取为净化方法的前处理过程进行讨论，最终确定异丙醇-氯仿-水法抽提得到的磷脂种类最多、含量最高。方法以PC（C28:0）、LPE（C14:0）、LPC（C14:0）、PG（C28:0）、PA（C28:0）、LPS（C16:0）为对照，探讨了方法的适应性。结果表明，该方法能够满足对圆椒磷脂含量测定的要求。