分子标记辅助选育含有抗稻瘟病基因和软米基因两系不育系水稻新品系

赵国超 王冬翼 张珍 王彤 吴雪源 曾文秀 李建粤

摘 要： 以“浦软粳S”为转育亲本，利用分子标记辅助常规育种技术成功培育出含有Pi9，Pita，Pib和Pigm稻瘟病抗性基因及软米基因（Wxmq），同时表现柱头外露率高的两系不育系水稻新品系“2179S”.“2179S”不育系茎秆粗壮，矮杆大穗，株高为63.8 cm，柱头外露率平均为60%.研究结果为今后培育具有稻瘟病抗性的优质两系杂交水稻新组合提供不育系亲本.

关键词： 两系不育系水稻; 稻瘟病抗性基因; 软米基因; 分子标记辅助选育

中图分类号： S 511  文献标志码： A  文章编号： 1000-5137（2019）05-0591-06

Abstract： Using “Puruan Ging S” as the parent，we have bred new two-line male sterile rice cultivars “2179S” containing high exerted stigma phenotype as well as Pi9，Pita，Pib，and Pigm rice blast resistance genes and soft rice gene（Wxmq） by molecular marker-assisted selection.The “2179S” showed strong stalks，short stems，large panicle，and itsaverage plant height was 63.8 cm.The stigma exertion rate was about 60%.The results providing sterile line parents for developing new combination of high quality two-line hybrid rice with resistance to rice blast.

Key words： two-line male sterile rice; blast resistance gene; soft rice gene; molecular marker-assisted selection

杂交水稻产量大多高于常规培育的水稻[1].我国杂交水稻有三系法和两系法2种类型.与三系法相比，两系法具有配组自由、种子生产成本低、无不育细胞质负效应、易转育新不育系等优点[2].目前，两系法杂交水稻配套、繁殖、制种等技术都已成熟，在我国水稻生产应用上已大面积推广.

稻瘟病是水稻种植的重要病害之一.在水稻生产中，提前使用农药可在一定程度上降低水稻稻瘟病病害的发生，但是会伤害生态环境.在生产中使用抗稻瘟病品种是最有效的措施.通过分子标记辅助选育含有稻瘟病抗性基因的两系不育系水稻，在我国已有一些成功报道[3-7]，这些品种都属于籼型水稻.目前上海市水稻种植面积约有 87000 hm2，其中杂交稻种植占据了较大的比例.上海市及其周边地区人们喜食粳型水稻，因此有必要培育适合在上海地区种植的抗稻瘟病杂交水稻.

本课题组利用分子标记辅助常规选育技术，已成功培育了高柱头外露率软米型的两系不育系水稻新品系“浦软粳S”（暂定名）.本研究将利用分子标记辅助常规育种技术进一步选育含有抗稻瘟病基因和软米基因，同时保持高柱头外露率的两系不育系水稻新品系.

1 材料與方法

1.1 实验材料

使用3种水稻作为亲本材料：第一个是在培育“浦软粳S”期间，曾获得含有柱头外露率高并含有纯合软米基因（Wxmq）的两系不育系中间材料“2629S”;第二个是从 “浦粳06A/42S”杂交后代中选育的高柱头外露、稻瘟病高抗性的可育水稻“B115”，该水稻含有抗稻瘟病基因Pi9，Pita，Pib和Pigm;第三个是“浦软粳S”.这3种水稻均由上海市浦东新区农业技术推广中心自主选育.

1.2 软米基因和抗稻瘟病基因鉴定

提取水稻叶片基因组DNA.按照谢米雪等[8]的报道对新选育的两系不育系水稻进行软米基因检测.参考韩笑等[9]的报道，分析新选育的两系不育系水稻的3种抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib.参考于苗苗[10]的报道，分析新选育的两系不育系水稻抗稻瘟病基因Pigm.

1.3 育性及农艺性状考察

采用显微镜观察两系不育系水稻花粉类型，同时通过套袋考察植株自交结实率.在两系不育系水稻开花时进行株高、穗数、穗长、柱头外露率等数据的考察.

2 结果与分析

2.1 选育过程及育性考察

2016年年初，以“2629S”为母本，“B115”为父本进行杂交，收获F1种子.F1植株再自交收获F2种子.对F2植株进行田间农艺性状考察，用显微镜观察其花粉的育性，选择矮杆大穗、柱头外露率高、花粉完全呈典败类型的单株，进行分子标记检测，筛选含有抗稻瘟病基因的植株，继续与“浦软粳S”两系不育系进行持续回交三代，得到BC3F1.在每次回交前都先采用分子标记对回交亲本进行抗稻瘟病基因检测，选取含有抗稻瘟病基因的植株再进行回交.随后在上海、海南两地以每年2～3代的速度进行穿插加代.在对自交后代筛选中，继续选择矮杆大穗，柱头外露率高，花粉完全为典败类型的单株，进行软米基因和抗稻瘟病基因检测，于2018年初获得软米基因纯合、抗稻瘟病基因纯合、其他农艺性状也基本稳定的两系不育系水稻新品系“2179S”（图1）.

“2179S”为光温敏核不育系，在长日照、高温时不育，在短日照、低温时可育.通过分期播种进行育性观察，“2179S”不育系均具有较长的稳定不育期，最早如4月30日播种，8月5日始穗;6月20日播种，9月10日始穗，植株均表现不育.如播期再推迟，在9月15日后始穗，植株开始转为可育.无论在上海还是海南，在可育期植株的结实率都较低.由此推测，“2179S”不育系具有较低的育性转换临界温度，育性较稳定.

2.2 软米基因检测

在蜡质（Wx）基因第4外显子+693处发生碱基替换突变，将导致水稻稻米合成直链淀粉含量降低[11-12]，使稻米呈现软米特征.利用谢米雪等[8]在Wx基因第4外显子+693处突变建立检测软米特性的CAPS（NlaIII）分子标记操作方法，Wx基因聚合酶链式反应（PCR）扩增产物总长度为557 bp，含有+693位点突变的Wx基因扩增产物经内切酶NlaIII消化后，成为380 bp和177 bp 2条带，而没有+693位点突变的Wx基因扩增产物长度保持557 bp（图2）.

2.3 抗稻瘟病基因鉴定

对于Pi9基因检测，DNA扩增产物电泳后含有397 bp和291 bp 2种相对分子质量不同的条带，其中仅仅含有291 bp条带的为纯合抗病植株，只含有397 bp条带的为感病植株，同时含有2种条带的为杂合植株，如图3（a）所示.对于Pita基因，DNA扩增产物如含有467 bp条带的为抗病植株，如图3（b）所示.Pib基因扩增产物也有2种条带，只含有803 bp条带的为感病植株，只有365 bp条带的为纯合抗病植株，同时有2种条带的为杂合植株，如图3（c）所示.对于Pigm基因2种DNA扩增产物中，只有1800 bp条带的为感病植株，同时有2种条带的为杂合植株，只有750 bp条带的为纯合抗病植株，如图3（d）所示.

2.4 农艺性状分析

2018年8月考察新培育的两系不育系水稻“2179S”的主要农艺性状：植株茎秆粗壮，矮杆大穗;平均株高为 （63.8±2.2）cm，平均每穴有效穗12.0±2.1，平均穗长为 （16.4±1.1）cm，千粒重（质量）约26.0 g，平均柱头外露率为60%.

3 讨 论

改良稻瘟病抗性是当前杂交水稻育种的主要目标之一[13].在水稻生长的任何一个时期都有可能发生稻瘟病.稻瘟病防控不当有可能会造成水稻大面积减产.预防具有高产或超高产的杂交稻发生稻瘟病，对于保障水稻产量及我国粮食安全具有重要意义.

本研究涉及4个抗稻瘟病基因：Pi9，Pita，Pib和Pigm.李婷等[14]报道Pi9是已克隆的基因中抗谱最广的抗性基因.有学者采用分子标记辅助将Pi9抗性基因导入不同恢复系水稻，均发现含有Pi9抗性基因的恢复系水稻与母本配制的杂交种对稻瘟病抗性比没有导入Pi9抗性基因的恢复系配组的杂交种有显著提高[15-17].王军等[18]报道同时携带Pita和Pib基因这2个抗性基因可以大大提高江苏省粳稻对穗颈瘟的抗性.廖常青等[7]将抗稻瘟病基因Pigm和Pi40分别导入两系不育系水稻“创5S”中，检测发现含有Pigm和Pi40基因的水稻对稻瘟病的抗性都有显著提高，并且含有Pigm抗病基因的“创5S”水稻比含有Pi40抗性基因的水稻对于稻瘟病的综合抗性更强.

对将Pi9抗性基因导入恢复系并与母本配组后的杂交稻种进行稻瘟病抗性研究，结果表明：Pi9抗性基因属于显性基因[15-17].还有一些研究也表明：水稻许多抗稻瘟病基因都属于显性基因[19-23].对于杂交稻而言，只要两个亲本中有一个亲本具有抗稻瘟病基因，后代植株就具有抗稻瘟病特性.孟秋成等[20]在杂交稻配组实践中也发现：当母本为抗病品种，无论配组所使用的父本品系对稻瘟病菌株表现抗、感或高感性，杂种F1代植株都表现出高抗病性.

张羽等[24]在研究抗稻瘟病基因位点数目多少與水稻品种抗病性的关系中发现：随着水稻抗性基因位点数目的增多，品种的抗病性呈上升趋势，由此认为稻瘟病抗性需要多个抗性基因的共同作用.本研究培育的3个两系不育系水稻新品系正是含有多个抗性基因的类型.由此推测，今后利用本研究培育的两系不育系水稻与恢复系制种获得的后代植株，对稻瘟病也可能具有较强的抗性.

近年来，随着市场对于稻米品质要求的提高，在两系不育系水稻育种中也有一些涉及软米选育方面的研究[25-26]，但是目前还未见进行稻瘟病抗性和米质同时改良方面的报道.本研究选育的新两系不育系除了具有多个抗稻瘟病基因外，还含有软米基因.今后使用这些两系不育系配组的杂交稻种，不仅可能抵抗稻瘟病，同时商品米的口感也会较好.

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（责任编辑：顾浩然）