10个马铃薯新品系遗传差异的SRAP分析

(内蒙古农业大学 农学院， 呼和浩特 010019)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)为一年生具块茎的粮、菜、饲兼用作物[1-2]。内蒙古是我国种薯与商品薯的重要生产基地，年种植面积约68万hm2。随着我国北方镰刀湾地区玉米种植面积调减计划的实施，马铃薯种植面积将呈增加趋势[3-4]。然而，目前优质、高产、抗逆性强的马铃薯新品种短缺已成为限制马铃薯产业发展的主要因素[5-6]，亟待研发适合内蒙古地区种植的马铃薯优良新品种。

在广泛收集、评价国内外马铃薯种质资源的基础上，开展了马铃薯杂交育种研究工作，选育出10个有重要栽培利用价值的马铃薯杂交新品系NNCS-38、NNCS-46、NNCS-02、NNS-MB 9、NNS-B 12、NNS-WD 35、NNS-07、NNS-A 1、NNS-A 6和NNS-A 10。为了明确这10个新品系在DNA水平上的遗传差异性，对下一步新品种的登记和保护利用提供分子依据，本试验拟利用成熟的SRAP(Sequence related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性)[7]分子标记技术进行检测分析。

1 材料与方法

1.1 材料及种植方式

材料为本课题组杂交育成的10个马铃薯品系NNCS-38(Red-P 1×黑美人F1株系38)、NNCS-46(Red-P 1×黑美人F1株系46)、NNCS-02(MIN-021×黑美人F1株系02)、NNS-MB 9(MB×027 F1株系09)、NNS-B 12(H-027×陇薯7号F1株系12)、NNS-WD 35(1867×陇薯7号F1株系14)、NNS-07(大西洋×陇薯6号F1株系07)、NNS-A 1(陇薯7号×MIN-021 F1株系A1)、NNS-A 6(陇薯7号×MIN-021 F1株系A 6)和NNS-A 10(陇薯7号×MIN-021 F1株系A 10)，原种由内蒙古农业大学马铃薯遗传育种研究所保存、提供。各材料于2018年5月种植在呼和浩特市托克托县马铃薯育种基地的网棚中，株距为25 cm，行距80 cm。土壤为沙壤土，肥力中等，生长期间适时适量施肥灌水，以确保马铃薯生育对养分和水分的需求，并注意防除杂草和病虫危害。

1.2 方 法

1.2.1DNA提取及质量检测

在马铃薯孕蕾期每种材料随机取幼嫩的叶片用冰盒保鲜带回实验室，各称取0.3 g放入研钵中，加适量液氮研磨成粉末，使用天根(北京)有限责任公司开发的植物基因组试剂盒提取其DNA。各取5μL的DNA溶液，用1.0%琼脂糖凝胶电泳对DNA的纯度进行检测，将符合要求的DNA稀释至50 ng·μL-1置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2.2SRAP引物来源以及合成

本试验所用SRAP引物来源于Pezzotti[8]、Li[9]和Lin等[10]已开发报道的引物，正向引物、反向引物均为12个，自由组合共获得144对SRAP引物，委托上海生工有限公司进行合成。

1.2.3SRAP-PCR扩增的反应体系及程序

体系：反应液总体积共20μL，含上下游引物各1.2μL、5 U·μL-1的Taq DNA聚合酶0.15μL、含Mg2+的10×PCR Buffer 2.75μL、2 mM的dNTPs 2.0μL、25 ng·μL-1的模板DNA 2.0μL、ddH2O 10.7μL。

程序：用Bio-Rad Mycycler Thermal Cycler仪进行PCR扩增，94 ℃模板DNA预变性4 min；94 ℃下变性60 s，35 ℃下复性60 s，72 ℃延伸60 s，循环5次；94 ℃下变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循环35次；72 ℃下延伸10 min，于4 ℃终止反应，取出置4 ℃冰箱低温保存。

1.2.4变性及电泳检测

在PCR扩增产物中加入变性剂5μL，94 ℃下变性5 min，冷却至4 ℃时点样。PAGE凝胶浓度为6%，电泳恒定功率70 W，电泳约80 min。电泳后胶板置固定液15 min，取出胶板用蒸馏水漂洗2 min，放入银染液中染色15 min，蒸馏水漂洗5 s后放入显影液中10 min，将显色后的胶板晾干扫描照相。

1.2.5SRAP多态性位点统计及聚类分析

利用0/1赋值法对SRAP扩增出的多态性条带位点进行统计，能清晰分辨的条带标记为“1”，没有条带的标记为“0”，缺失记“-”，生成“0”、“1”的原始二元数据矩阵。多态性条带位点百分率(%)=(多态性条带数/扩增条带总数)×100%，即P=(K/N)×100%[11]。

利用软件Data Processing System V 8.01计算出各新品系间的遗传距离，采用非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯新品系基因组DNA的质量检测

从图1看出，10个马铃薯新品系DNA电泳条带清晰、均匀且稳定，没有弥散和拖尾现象，表明所提取的DNA质量可以满足SRAP分子标记试验的要求，可用于进行PCR扩增。

注：M.D 2000；1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9；5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1；9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。 图1 10个马铃薯品系的基因组DNA质量电泳检测结果

2.2 马铃薯新品系SRAP适宜引物的筛选和多态性分析

用马铃薯新品系NNCS-38、NNS-07、NNS-WD 35和NNS-A 1这4个材料的DNA为模板进行SRAP引物筛选，从144对引物中筛选出电泳条带稳定清晰、多态性丰富的SRAP引物10对(图2、表1)。用这10对引物对10个马铃薯新品系基因组DNA进行扩增，扩增的DNA片段范围在300～1 000 bp之间，共产生208个位点条带；其中多态性位点条带165个，平均每对引物扩增出多态性位点条带16.5个，多态性比率占79.33%，表明10个新品系间的遗传差异较大。

表2 马铃薯品系间的SRAP遗传距离矩阵

表1 SRAP适宜引物的碱基序列和多态性扩增结果

引物上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')扩增位点总数多态性位点数多态性位点百分率/%m1/e7TGAGTCCAAACCGGATAGACTGCGTACGAATTCAA161381.25m2/e6TGAGTCCAAACCGGAGCGACTGCGTACGAATTGCA342676.47m3/e1TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTAAT221881.82m3/e3TGAGTCCAAACCGGAATGACTGCGTACGAATTGAC201680.00m5/e10TGAGTCCAAACCGGAAGGACTGCGTACGAATTCAG211676.19m9/e6TGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTGCA211780.95m9/e9TGAGTCCAAACCGGACAGACTGCGTACGAATTCGA201575.00m12/k2TGAGTCCAAACCGGGGAGACTGCGTACGAATTCGAG201785.00m14/be7TGAGTCCAAACCGGCTAGACTGCGTACGAATTCAA191578.95bm8/be10TGAGTCCAAACCGGACTGACTGCGTACGAATTCAT151280.00合计208165 79.33(均值)

注：1.NNCS-38；2.NNS-07；3.NNS-WD 35；4.NNS-A 1。图2 马铃薯新品系部分SRAP适宜引物的筛选结果

另外，通过对10对适宜引物电泳结果的比对，选出1对能在DNA水平上清晰地区分出各新品系的SRAP引物m 3/e 1，经PCR扩增建立了10个马铃薯品系的SRAP指纹图(图3)，为新品种的登记和保护利用提供了分子依据。

2.3 马铃薯新品系的聚类分析

由表2可知，10个马铃薯新品系的遗传距离(GD值)变幅在0.219 5～0.740 5之间，平均值为0.502 7。其中新品系NNS-A 1与NNS-A 10的GD值最大，为0.740 5；其次是NNS-A 1与NNS-A 6，GD值为0.708 1；GD值最小的是NNS-A 6与NNS-A 10，为0.219 5。

注：M.100 bp；1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9； 5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1；9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。图3 用特异性引物m 3/e 1对10个马铃薯品系 基因组DNA扩增的SRAP指纹图

10个马铃薯材料聚类分析结果如图4所示。以GD值0.50为基准，可将10个马铃薯新品系分为4类：第一类为新品系NNCS-38、NNCS-46和NNS-07；第二类为新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-A 10；第三类为新品系NNS-B 12和NNS-A 1；新品系NNCS-02单独为一类。该研究结果可为进一步开展马铃薯改良杂交材料选择和组配提供可靠依据。

注：1.NNCS-38；2.NNCS-46；3.NNCS-02；4.NNS-MB 9； 5.NNS-B 12；6.NNS-WD 35；7.NNS-07；8.NNS-A 1； 9.NNS-A 6；10.NNS-A 10。图4 10个马铃薯品系的聚类结果

3 讨 论

SRAP分子标记技术因具有引物通用性广、多态性丰富、成本低廉的特点[12]，已被应用于多种植物的遗传多样性分析、连锁图谱构建、QTL定位及品种鉴定等方面，如甜瓜[13]、国兰[14]、冰草[15]、小麦[16]、蓝莓[17]等。本试验用筛选出的10对SRAP适宜引物，对课题组选育出的10个马铃薯新品系基因组DNA进行PCR扩增及多态性分析显示，各材料间的多态性比率较高(79.33%)，并用筛选出的1对特异性引物m 3/e 1，建立了能清晰地识别出各材料差异的SRAP指纹图，这表明SRAP技术用于马铃薯新品系鉴定是可行的。

作物的聚类分析是将不同品种、品系材料按照亲缘关系的远近进行分类的过程，在同一类别的品种或品系间有较高的遗传相似性，而不同类别的品种或品系间遗传差异性较大。为了拓宽遗传背景，提高杂交后代性状变异的几率，通常在杂交亲本选择过程中需选择亲缘关系相对较远的材料。聚类分析的结果可清晰、直观的体现出各材料间的亲缘关系远近的程度，减少在亲本选配时的盲目性，有效地缩短遗传改良的进程。本试验以遗传距离(GD值)0.50为基准时，将10个马铃薯新品系材料清晰地区分为4类，其中新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-10为一类，表明其亲缘关系相对较近；但品系NNS-MB 9和NNS-WD 35为同一亚类，而品系NNS-A 6和NNS-10为另一相同亚类，这表明两者间仍存在一定的遗传差异。此外，在田间观察到，品系NNS-MB 9和NNS-WD 35均为中早熟，品系NNS-A 6和NNS-10为中晚熟，二者在熟性上相差10 d以上，表明这种熟性上的差异与2个不同亚类的划分具有一定的相关性，其原因有待进一步研究。

4 结 论

1) 试验筛选出10对适宜马铃薯新品系的SRAP引物，经PCR扩增得到多态性位点条带165个，多态性比率为79.33%，品系间的遗传差异较大。

2) 用特异性引物m 3/e 1进行扩增和凝胶电泳建立了能明确识别10个马铃薯新品系的SRAP指纹图谱，为下一步新品种登记及保护利用提供了分子依据。

3) 10个马铃薯新品系间的遗传距离(GD值)范围为0.219 5～0.740 5，平均值0.502 7。以GD值0.5为基准，将10个马铃薯优良新品系划分成四类：新品系NNCS-38、NNCS-46和NNS-07为一类；新品系NNS-MB 9、NNS-WD 35、NNS-A 6和NNS-A 10为一类；新品系NNS-B 12和NNS-A 1为一类；新品系NNCS-02单独为一类。这一研究结果可为进一步进行马铃薯改良杂交材料的组配利用提供依据。