同时检测动物布鲁菌病和结核病胶体金抗体检测试纸条的研制

郭 健 ，张 月 ，李 艳 ，董 媛 ，刘 微 ，杨艳玲

（1.吉林医药学院，吉林 132013；2.中国农业科学院特产研究所 特种经济动物分子生物学重点实验室，长春 130122）

布鲁菌病（brucellosis）和结核病（tuberculosis）是危害畜牧业较严重的两类人兽共患传染病，牛、羊、鹿、猪、犬是主要易感动物[1-3]。前者由布鲁菌（Brucella）引起[4]，后者由牛分枝杆菌复合群（M.tuberculosis complexand）或牛分歧杆菌（M. bovis）引起[5]。布鲁菌病简称布病，可引起雌性动物流产和繁殖力下降，雄性发生关节炎、睾丸炎和产茸量降低等[6]。结核病可致动物多个器官发生结核，体型消瘦，最后器官衰竭而死亡[7]。布病和结核病都属于人畜共患、多宿主感染的慢性传染病，不仅给养殖业带来很大损失，也对公众的健康造成严重危害，是世界范围的重要公共卫生问题之一[8,9]。

目前世界各国对动物布病和结核病的防治措施主要是“检疫-扑杀”，因此准确的诊断显得尤为重要。当前，动物布病的诊断方法主要有虎红平板凝集试验（Rose- Bengal plate agglutination test，RBT）、试管凝集试验（serum tube agglutination test，SAT），但这些诊断方法存在判定标准不严格，特异性差的缺点[10,11]。结核病使用传统的皮内变态反应（purified protein derivative，PPD）和血-γ干扰素释放实验（interferon-gamma release assay，IGRA）来筛查感染动物，这两项技术操作繁琐，同时也存在特异性差、敏感性低的缺点[12,13]。检测技术的不完善给布病和结核病的诊断和防治带来诸多困难，从而造成两种传染病在养殖动物中广泛流行。因此，建立一种快速简单、敏感性强、特异性高、低成本的诊断方法势在必行。本研究利用羊种布鲁菌LPS和重组牛分歧杆菌MPB70蛋白作为检测抗原，研制的同时检测动物布病和结核病的胶体金抗体检测试纸条用于动物布病和结核病的临床快速诊断。

1 材料与方法

1.1 菌种、血清和动物羊种布鲁菌强毒株16M（B.melitensis，16M）由中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学重点实验室保存。血清样品采集自吉林省敦化市、左家镇、东风县养殖场和湖南吉湘鹿场；新西兰大白兔（2～4 kg）购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心。

1.2 试剂重组牛分歧杆菌MPB70蛋白，前期由本实验室表达并纯化[14]；LPS定量试剂盒购自泉州科诺迪生物；DNA酶、 RNA酶、蛋白酶K购自Thermo公司；Brucella broth购自Acumedia公司；银染试剂盒购自Bio-Rad公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、BSA购自Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.3 材料30 nm胶体金溶液、硝酸纤维素膜（Sartorius CN 140）、结合垫（PALL XQ-Y2，玻纤膜）、样品垫(Ahlstrom 8964，玻纤膜）、吸收垫、PVC底板、塑料卡均购自上海杰一生物技术公司。

1.4 抗原抗体制备

1.4.1 布鲁菌LPS的提取和纯化 将羊种布鲁菌16M 接种于Brucella Broth液体培养基中。37℃、180 r/min摇床培养至OD600=1.2～1.5，将菌液83℃水浴灭活30 min。5000×g离心收集菌体，PBS洗涤2次，重悬备用。按照改良后的热酚法[15]提取16M的LPS。粗提LPS经超纯水透析，PEG8000浓缩后，加DNA酶和RNA酶各50 μg/mL，37℃酶解2 h。再加15 μg/mL蛋白酶K，37℃酶解1 h。冰浴冷却，1500×g离心20 min，上清液加2倍体积无水乙醇，沉淀后获得LPS，用LPS定量试剂盒测定浓度。纯化后的LPS经SDS-PAGE分离、银染后检测。

1.4.2 LPS的免疫原性分析 用提取的LPS作为抗原，自然感染布鲁菌的鹿阳性血清和牛阳性血清（RBT和ELISA试剂盒检测均为阳性）作为抗体进行琼脂糖免疫扩散试验[16]，37℃温箱孵育24 h后，观察反应结果。

1.4.3 兔抗LPS、MPB70多克隆抗体的制备 使用纯化的LPS和MPB70蛋白作为抗原分别免疫新西兰大白兔。采用背部皮下多点注射，分别于第0、2、4、6周共免疫4次。第1次免疫前将抗原按照1∶1的比例与弗氏完全佐剂充分混合，后3次免疫采用抗原按照1:1的比例与弗氏不完全佐剂充分混合。每次免疫抗原量为400 μg/只。第7周心脏取血。37℃放置析出血清，-80℃保存备用。

1.5 抗原标记条件确定

1.5.1 胶体金标记LPS和MPB70蛋白最佳pH值确定取20支离心管，每组各10支。每管加1 mL胶体金溶液，用3% K2CO3溶液调节胶体金溶液pH值（表1）。分别向两组离心管中加80 μg LPS和MPB70蛋白，充分混匀后，静置30 min。再分别向上述各管加入 100 μL 10% NaCl溶液，充分混匀后，静置1 h。通过OD550值[17]检测并结合肉眼观察来确定最佳pH值。OD550值最大处对应pH值为最佳，维持溶液红色最小pH值为最佳。

表1 每管胶体金溶液的pH值Table 1 pH of each colloidal gold solution

1.5.2 胶体金标记LPS和MPB70蛋白最佳浓度确定 将胶体金溶液调至最佳pH值，分别添加1 mL到每支离心管中，按照 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg 的抗原量分别向每组的10支离心管中加入LPS和MPB70蛋白，充分混匀后，静置30 min；再加入100 μL 10% NaCl溶液，充分混匀后，静置1 h，通过OD550值检测并结合肉眼观察来确定抗原最低标记浓度。OD550值为纵坐标，抗原浓度为横坐标绘制曲线，曲线平衡拐点处对应最低标记浓度（维持溶液红色的最低浓度）。最佳标记浓度=最低浓度×120%。

1.6 金标垫的制备3%K2CO3调节胶体金pH值分别为7.5（LPS组）、7.7（MPB70组）；根据最佳浓度添加抗原，充分混匀，静置30 min；再加BSA至终浓度1%，继续搅拌20 min，静置15 min使抗原与胶体金颗粒稳定结合。将结合垫置于封闭液（pH7.4，0.01 mol/L PBS，含1%BSA、0.2% Tween-20和5 mmol/L NaCl）中，37℃封闭30 min。处理好的结合垫切割成宽度0.40 cm的长条。在金标抗原中加0.2%蔗糖，充分溶解后，均匀地加到金标结合垫上至饱和，室温晾干，即为金标垫。

1.7 检测线（T线）和质控线（C线）划膜将硝酸纤维素膜（有背衬）浸入甲醇溶液内敏化10 min。将膜至于处理液（pH 7.4，0.01 mol/L PBS，含0.2%Tween-20、5 mmol/L NaCl和5 mmol/L蔗糖），37℃浸泡30 min，PBS 洗涤2次，常温晾干。LPS和MPB70蛋白T线的抗原喷膜浓度分别0.25 mg/mL和0.5 mg/mL。C线上LPS和MPB70蛋白多克隆抗体划线量分别为1 μL/cm和2 μL/cm。用JY-EQ03 连续式划膜仪将抗原抗体包被在硝酸纤维素膜上，包被后用1% BSA封闭30 min，4℃干燥。

1.8 样品垫处理用0.01 mol/L PBS（含3% BSA和1%Tween-20，pH 7.4）浸泡样品垫，常温晾干。

1.9 试纸条组装及结果判定依次将硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸收垫粘贴到PVC底板。分切试纸条宽度为4 mm，组装双联检测卡。检测时，向样品孔处加样（3～5倍稀释的新鲜血清）100 μL，10 min后判定结果。根据 T 线、C 线的显色条带判定样品为阳性、阴性或者是试纸条失效（C线不显色）。

1.10 特异性试验用制备的试纸条分别对牛、鹿布鲁菌病血清、结核病血清、口蹄疫血清、巴氏杆菌病血清、耶尔森氏菌病血清进行检测，观察有无交叉反应。

1.11 敏感性试验将鹿布鲁菌病血清（RBT和SAT检测均强阳性）和结核病血清（PPD和γ-干扰素ELISA检测均强阳性）进行倍比稀释后，使用试纸条进行检测，记录显示阳性的最大稀释倍数。

1.12 符合率检测对临床采集的206份牛血清和387份鹿血清进行虎红平板凝集试验（RBT）、γ-干扰素ELISA和试纸条检测，比对符合率，评价试纸条检测结果的可靠性。

1.13 临床样品检测组建3000条检测卡，在珲春市、图们市、敦化市、舒兰市、长岭县，长白朝鲜族自治县、四平市等地开展了推广试验，在基层养殖场进行现场检测。

2 结果

2.1 布鲁菌LPS提取用改良的热酚法提取羊种布鲁菌强毒株16M的LPS，纯化后用LPS定量试剂盒检测浓度为0.23 mg/mL。经SDS-PAGE分离、银染检测，显示提取的LPS为均匀抹带（图1）。

图1 布鲁菌LPS经 SDS-PAGE银染结果Fig.1 SDS-PAGE with silver staining of Brucella LPS

2.2 LPS免疫原性分析LPS琼脂糖免疫扩散试验结果如图2所示，中间孔为提取的LPS，1～5孔分别为自然感染布鲁菌的鹿和牛阳性血清，6为PBS对照孔。结果显示，LPS孔周围均出现明显的沉淀线，证明提取的LPS具有较强的免疫原性。

图2 LPS与布鲁菌阳性血清的琼脂糖免疫扩散反应Fig.2 Agarose immunodiffusion reaction between LPS and Brucella positive serum

2.3 抗原最佳标记pH值和标记浓度根据pH值-吸光值曲线（图3A）及肉眼观察，LPS与胶体金结合的最佳pH值为1 mL胶体金溶液中加入 3% K2CO3溶液6 μL，即pH值7.5。MPB70蛋白与胶体金结合的最佳pH值为1 mL胶体金溶液中加入3% K2CO3溶液8 μL，即pH值7.5。根据浓度-吸光值曲线（图3B）及肉眼观察，LPS最低标记浓度为30 μg/mL，则最佳标记浓度为30×120%=36（μg/mL）。MPB70蛋白的最低标记浓度为20（μg/mL），则最适蛋白浓度为20×120%=24（μg/mL）。

图3 抗原最佳标记pH值（A）和浓度(B)确定Fig. 3 Determining of the antigen optimal labeling pH（A）and optimal labeling concentration(B)

2.4 试纸条组装和结果判定试纸条组装如图4A 所示：1—硝酸纤维素膜、2—金标垫、3—样品垫、4—吸收垫、5—PVC底板。将试纸条组装成双联检测卡。判定结果如图4B 所示， 可同时对检测动物布鲁菌病和结核病进行检测，试纸条显示的条带清晰，显色稳定，无拖带，能较好地鉴别临床上布鲁菌病和结核病的阴性和阳性。

图4 胶体金试纸条Fig.4 Colloidal gold test strip

2.5 特异性测试用制备的试纸条分别对牛鹿布鲁菌病血清、结核病血清、口蹄疫血清、巴氏杆菌病血清、耶尔森氏菌病血清进行检测，结果显示无交叉反应，证明试纸条特异性良好（BR:布鲁菌病；TB：结核病）。

2.6 敏感性试验胶体金试纸条检测倍比稀释的布鲁菌病和结核病阳性血清，显示可检测到阳性的血清最大稀释倍数均为1∶512。

2.7 符合率检测对临床采集的206份牛血清和387份鹿血清进行检测。比对虎红平板凝集试验（RBT）和胶体金试纸条检测（GICA）检测结果、反刍动物结核γ-干扰素ELISA（IGRA）和胶体金试纸条检测结果的符合率，检测结果如表3所示。

RBT检测布鲁菌病总阳性率为6.57%，GICA检测布鲁菌病总阳性率为10.3%；GICA与RBT方法比较，阳性符合率100%，阴性符合率为96%，总符合率为96%。IGRA检测结核病总阳性率为21.2%，GICA检测结核病总阳性率为22.4%；GICA与IGRA方法比较，阳性符合率94%，阴性符合率为97%，总符合率为96%。比较结果说明两组方法符合性较好。

2.8 临床样品检测采用试纸条检测卡在基层养殖场进行现场检测，结果清晰，判定简单。部分检测结果如图5所示。

图5 临床样品检测结果Fig.5 Partial clinical test results of test strips

表2 试纸条特异性检测Table 2 Specific detection of colloidal gold test strip

表3 GICA、RBT和IGRA三种方法检测结果Table 3 Comparison of detection results of GICA, RBT and IGRA

3 讨论

布鲁菌病和结核病都是危害动物健康养殖和公共卫生安全的重要人畜共患传染病[18]。目前，有170多个国家和地区存在布病流行，因其造成的经济损失高达约30亿美元[19]。同时，结核病作为世界危害最大的人畜共患病之一[20]，在人和动物间具有广泛的传播性，自1993年世界卫生组织就宣布结核病已成为公共健康急症[21]。大量数据显示人类布病和结核病的发病率与畜间布病和结核病的发病率呈正相关。近年来检测技术不断革新。宫晓炜等[22]利用BP26作为包被抗原，建立的iELISA方法，与SAT检测结果符合率达93%。王志明等[23]利用Brucella-5C10 作为竞争抗体，建立了cELISA 方法，减少了假阳性的出现。王素华等[24]、杜琳等[25]设计了omp31、omp25特异性引物，PCR扩增测序，符合率达99%。Queiros等[26]和Wadhwa等[27]分别利用结核菌蛋白抗原别建立ELISA和EVELISA（乙醇涡 ELISA）排除感染结核菌的偶蹄动物，特异性良好。杨雷[28]利用PCR扩增结核菌HSP65 基因片段检测鹿结核病。王春雨[29]研究发现TaqMan PCR检测结核病特异性优于ELISA。虽然报道的ELISA和PCR方法结果良好，但目前多处于实验室研究层面，应用于基层快速检测仍存在困难。

胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatographic assay，GICA）具有特异性好，敏感性高，肉眼可读，操作简便的优点，近年来在动物疾病诊断和检疫中得到广泛应用[30]。LPS是细菌表面毒力因子，可引起机体免疫应答，是布鲁菌特异性诊断方法常用的抗原，并且比其他蛋白抗原物质稳定持久。本研究优化了LPS的提取方式，提高了纯度和含量，更利于用LPS建立布鲁菌快速诊断方法。MPB70蛋白是结核分枝杆菌的分泌型蛋白，具有较强的免疫原性。利用羊种布鲁菌16M株的LPS和牛分枝杆菌MPB70蛋白作为抗原研制的胶体金抗体检测试纸条，可同时检测动物布鲁菌病和结核病，而且所有动物都可以使用，更有利于临床兽医和饲养场进行布病和结核病的诊断。将研制的试纸条检测结果与布病的RBT方法比较，阳性符合率100%，阴性符合率为96%；与结核病γ-干扰素ELISA方法比较，阳性符合率94%，阴性符合率为96%。检测结果证明试纸条具有较高的敏感性和特异性。由于RBT和γ-干扰素ELISA方法具有局限性，我们又结合ELISA抗体检测试剂盒检测不符合的样品，结果与试纸条一致。

采用研制的试纸条在基层养殖场开展了推广应用，临床测试效果良好，适用于养殖户和基层兽医现场检测，也为动物布病和结核病的净化提供了技术保障。