自噬在创面愈合中的作用研究进展

冷敏 彭颖 林晓莹 汪虹

昆明医科大学第二附属医院烧伤科（昆明650188）

创面愈合是涉及一系列复杂生物学行为的动态过程，分为4个伴随和重叠的阶段：炎症、血管再生、再上皮化与胶原蛋白沉积［1］。既往研究［2］表明，多种细胞及细胞因子在创面愈合中起着重要作用，目前已有研究证实自噬参与调控间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）治疗创面修复相关［3］，但事实上，自噬除了参与调控MSCs功能之外，也在调控创面愈合各个阶段相关细胞的功能中发挥重要作用。自噬（autophagy）是溶酶体与细胞内成分（细胞器、蛋白质等）融合、降解，最终实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器更新的过程。研究显示［4-5］，自噬参与了多种细胞功能的调控，并与多种疾病发生发展密切相关，包括癌症、衰老、创伤等，已成为当今基础生命科学和医学研究的热点之一。现本文通过查阅国内外最新文献，旨在总结自噬在创面愈合中的相关作用机制，以期为今后进一步通过调控自噬从而改善创面愈合提供理论依据及实践基础。

1 自噬的分类及作用过程

目前普遍认为自噬主要以三种形式存在——伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬——其主要区别在于它们的生理功能和向溶酶体的传递方式不同［6］。其中巨自噬是自噬中研究最广泛的形式，巨自噬（以下简称自噬）指对细胞内蛋白质和核酸以及细胞质、部分细胞器和细胞膜等成分的降解过程［7］。当前研究表明，自噬主要有两种类型——非选择性自噬和选择性自噬，非选择性自噬是指位于自噬小体形成位点的细胞质成分被随机分配到自噬体中；相反，在选择性自噬过程中，某些分子、结构和细胞器被称为“自噬受体”的特殊蛋白质所识别和吞噬，细胞根据自身状态利用这些不同类型的自噬来维持自身的稳态或调节其功能［8-10］。

完整的自噬过程被描述为自噬通量，包括自噬体的形成，自噬体与溶酶体的融合，以及溶酶体中物质的降解［11］。相关研究表明自噬通常由一种称为ULK多蛋白复合物介导启动的，ULK1与ATG13、ATG101以及FIP200相互作用，形成ULK复合物［12］，它在细胞内起着应激和营养传感器的作用［13］。该复合物是自噬的关键启动因子，其活性主要通过mTORC1和AMP活化蛋白激酶（AMPK）在不同位点磷酸化来调控，最终将细胞内容物转移到溶酶体的双膜小泡进行降解［14-15］。ULK复合物激活触发Ⅲ类PI3K复合物Ⅰ（PI3KC3）上的多个蛋白磷酸化，包VPS34、Beclin⁃1、LC3、VSA15和Atg14等，这些蛋白的磷酸化激活PI3KC3信号通路［16］。其中LC3蛋白在Atg4半胱氨酸蛋白酶作用下形成LC3 I，再与PE结合形成自噬体膜的主要成分LC3 II［17］。

2 自噬与创面愈合

2.1 自噬可改善创面炎症炎症期是创面损伤后的第一个阶段，炎性细胞大量活化，导致炎性细胞因子失控释放，进而导致创面炎症反应，而促进自噬可抑制炎性细胞因子的生成，有助于炎症的消退，而减少炎症对于预防组织损伤和随后的纤维化至关重要［18］。例如，有报道称自噬相关蛋白的缺乏会诱导炎性小体异常激活，从而导致严重的组织损伤，相反自噬诱导剂可通过调控自噬相关蛋白显著改善了炎性体相关疾病的症状［19］。而胸腺素β4（Tβ4）是已知的具有抗炎活性的物质，相关研究表明胸腺素β4（Tβ4）抗炎活性主要通过诱导自噬发生，可促进伤口的愈合。RENGA等［20］发现Tβ4可通过激活LAP/DAPK1信号途径，下调NF⁃κB，明显降低炎性细胞因子（如TNF⁃α），进而抑制炎症的发生。这就提示通过Tβ4增强自噬活性是抑制炎症的潜在方法。此外，最近CHIU等［21］在用远红外（FIR）治疗深Ⅱ度烧伤大鼠模型的研究中发现，FIR不仅增加了巨噬细胞中自噬小泡的形成，且诱导了LC3⁃II，Beclin⁃1的表达的增加，进而激活自噬，最终抑制了NLRP3炎性体的形成并减少了IL⁃1β的分泌；另一方面FIR也可诱导ASC的泛素化，并限制NLRP3炎性体的活性，从而增加创面愈合率。总之，Tβ4和FIR两者都可通过调控自噬，减少炎症期相关炎症因子产生，进而减轻炎症。

2.2 自噬可诱导创面血管生成创面损伤常常伴随着血管缺损，造成创面缺氧和随后ROS积累导致的氧化应激，最近有研究表明，缺氧可激活自噬相关蛋白，从而刺激ECs增殖和分化，并诱导血管生成［22］。有研究人员用红景天苷处理被过氧化氢损害的人脐静脉内皮细胞，结果显示红景天苷可通过激活AMPK促进自噬相关蛋白Beclin⁃1，LC3⁃II/LC3⁃I表达明显上升，且细胞凋亡减少，细胞活力的显着提高［23］。提示红景天苷诱导自噬可能通过调节ECs的适应性来保护细胞免受氧化应激损伤，进而提升ECs活力，为红景天苷作用于创面血管再生打下基础。ERK是一种泛素激酶，ERK信号通路在VEGF旁分泌中起重要作用。有研究发现，对C57小鼠进行全层皮切除，同时局部注射雷帕霉素（自噬激动剂）干预的MSCs，诱导LC3⁃II表达可通过MAPK/ERK1/2信号通路刺激MSCs中VEGF旁分泌，促进ECs形成，有助于创面血管再生［24］。说明自噬可激活ERK信号通路上调VEGF的表达，为自噬调节MSCs治疗作用提供了新见解。

2.3 自噬有助于创面再上皮化创面再上皮化是角质形成细胞从基底层向角质层迁移并同时发生增殖与分化的过程。因创面血管破裂及伤口边缘的耗氧量增加，角质形成细胞迁移多在缺氧环境中进行［25］。研究证明，由缺氧环境介导的ROS积累可触发角质形成细胞中p38和JNK MAPK的激活，进而上调了BNIP3诱导的自噬，并导致LC3、Atg5、Beclin⁃1等的表达明显增加，促进表皮角质形成细胞迁移［26］。但缺氧导致过量ROS的积累对伤口修复是不利的，而瑞芬太尼可减少ROS的产生。近期KIM等［27］通过对比瑞芬太尼预处理过氧化氢组、过氧化氢组、3⁃MA（自噬抑制剂）+瑞芬太尼预处理过氧化氢组人角质形成细胞，结果显示瑞芬太尼预处理过氧化氢组的Atg5，Beclin⁃1，LC3⁃II表达明显上升，且该组人角质形成细胞自噬体也显著增多，而凋亡相对减少，同时增加了细胞迁移。该研究不仅证明瑞芬太尼预处理可改善过氧化物诱导的人类角质形成细胞的氧化损伤，而且还证明了瑞芬太尼的抗氧化作用是通过自噬介导的，自噬激活可以抗氧化损害，帮助创面再上皮化。此外，有研究证实角蛋白对再上皮化形成也至关重要，如李雄等［28］在研究中发现在深Ⅱ度烫伤动物模型中，用暴露烧伤疗法（MEBT）/湿润烧伤膏（MEBO）均匀涂抹创面，可通过上调自噬相关蛋白Beclin⁃1，LC3，使角蛋白19的表达升高，进而促进创面再上皮化。

此外，有学者［29］发现皮肤电场变化也激活自噬，参与了创面愈合过程。完整皮肤中存在跨上皮电势差（trans⁃epithelial potential，TEP），但是在创面形成后，TEP会立即消失，同时产生内源性伤口电场（EF），即创面内部带有负电被称为阴极，伤口周围完好组织带正电被称为阳极，以便细胞向伤口中心定向迁移［30］。有学者证实，磷酸酶和张力同源物（PTEN）和PI3K是感应EF的关键因子，其中PTEN又是PI3K的负性调控因子，已有研究发现EF通过下调PTEN激活PI3K信号通路中的mTORC1的活性，并诱导LC3⁃II的表达增加，进而诱导自噬激活，加快角质形成细胞产生上皮⁃间充质转换（epithelial⁃to⁃mesenchymal transition，EMT）和定向迁移速度［31］；此外，YAN等［32］学者发现创面的缺氧环境可以通过下调AMPK诱导mTORC1下游靶点p70S6K（Thr389），4E⁃BP1（Thr70）表达上升来促进细胞运动，从而促进创面再上皮化。YAN等［33］研究团队进一步证实EF通过诱导自噬活性即LC3⁃II增多，增强角质形成细胞迁移的距离和速度，但其迁移不是方向性的而是自噬体依赖性的，即EF以恒定自噬通量诱导自噬体形成的时间依赖性。此结果揭示了EF的作用机制，即增强EF使细胞定向运动的调节剂是自噬，为EF促进创面愈合提供了新视角。

2.4 自噬促进创面瘢痕形成瘢痕是创面损伤后皮肤结缔组织修复的结果，其特点是成纤维细胞的增殖与胶原蛋白的沉积等。创面在形成瘢痕时，成纤维细胞中LC3阳性点数量增加，且创面边缘高于中心［34］，表明自噬与成纤维细胞的功能相关。YOON等［35］通过对比瑞芬太尼预处理过氧化氢组、过氧化氢组、3⁃MA+瑞芬太尼预处理过氧化氢组人皮肤成纤维细胞，结果显示瑞芬太尼预处理过氧化氢组通过PI3K信号通路上调ATG5、Becline⁃1、LC⁃3 II的表达，激活自噬，进而激发人皮肤成纤维细胞对氧化应激的保护作用，使细胞中的氧化应激作用减轻，促进成纤维细胞增殖，帮助创面修复。当皮肤受到热损伤时，胶原蛋白会产生变性，变性的胶原蛋白一方面作用于procas⁃pase⁃3，使其表达下降，减少细胞凋亡；另一方面随着变性胶原蛋白浓度的增加和时间的延长可通过PI3KC3途径上调LC3⁃II/LC3⁃I和beclin⁃1的表达，显著增加人皮肤成纤维细胞的自噬水平，最终帮助细胞存活［36］，促进了创面瘢痕形成。

此外，有学者证实抗凋亡蛋白Bcl⁃2和BAG3表达上调促进了自噬从而参与了瘢痕形成。JIAN⁃LI研究团队在他们的研究中发现，用五谷虫提取物涂抹全层皮切除的大鼠动物模型时，五谷虫提取物不仅激活了自噬，使Beclin 1、LC3 II表达增加；而且激活了Smad2/TGF⁃β和STAT3信号通路，使下游效应分子BAG3和Bcl⁃2表达增加，致使抗凋亡活性增强，进而减少伤口组织中成纤维细胞的凋亡，最终增加成纤维细胞及TGF⁃β的数量，促进胶原蛋白形成，提升创面愈合率，缩短创面愈合时间［37］。这就表明Bcl⁃2和BAG3表达上调促进了自噬从而参与了创面愈合。而有研究员从反方向证明了Bcl⁃2表达上调促进了自噬，从而参与了创面愈合中的瘢痕过程，MYTYCH等［38］的发现成纤维细胞中的一种抗炎蛋白klotho的沉默，可使caspase⁃3增多和Bcl⁃2表达下调，并诱导成纤维细胞凋亡；此外，还可导致ATG16L和LC3表达的减少，而自噬则被抑制，进而诱导NF⁃κB和IGF⁃IR通路激活，促炎因子TNF⁃α，IL⁃6，IL⁃1β的分泌增加及抗炎因子IL⁃10的分泌抑制，最终抑制成纤维细胞增殖，伤口愈合过程显著被抑制。

2.5 糖尿病慢性创面以上研究均证实自噬参与了创面愈合的多个阶段。随着近年来糖尿病慢性创面的进一步研究，有学者发现在高糖背景下自噬也参与了创面愈合相关细胞的作用过程。高糖环境下，角质形成细胞的迁移能力受损，LINGFEI等［39］用高浓度葡萄糖干预角质形成细胞，通过下调p38/MAPK信号途径使自噬相关蛋白Atg5和LC3⁃II的表达显着降低，自噬被抑制，细胞迁移速度下降；而p38/MAPK激活剂MKK6可显著改善细胞自噬，促进细胞迁移。褪黑素是AMPK信号传导的激活剂，JIN等［40］证实采用糖尿病小鼠进行全层皮切除，同时每天腹膜内注射褪黑激素溶液10 mg/kg，不仅可以使Bcl⁃2表达上调，Bax、caspase⁃9和细胞色素c表达降低，明显减轻EPCs凋亡；同时还可以通过激活AMPK信号途径提高LC3⁃II/LC3⁃I比率，降低p62蛋白质水平，增强EPCs中自噬通量，最终促进EPs迁移和粘附，毛细血管数量明显增加，缩短糖尿病慢性创面愈合时间。MEBT/MEBO是一种中医疗法，可大大提高临床上溃疡伤口愈合的有效性，AITIAN等学者［41］用糖尿病大鼠进行全层皮切除，MEBT/MEBO组通过激活了PI3K⁃Akt⁃mTOR信号通路激活自噬，促进糖尿病溃疡伤口的修复与愈合。综上所述，外部干预可改善糖尿病环境下受损的细胞活性，这为糖尿病慢性创面的临床干预提供新见解。

3 展望

综上所述，自噬贯穿了创面愈合的整个过程。研究证实自噬在创面愈合过程中可减少炎性因子的产生、促进ECs增殖、再上皮化和瘢痕形成，其也可改善高糖环境下受损的细胞活性，因此进一步明确自噬在创面愈合过程中的具体作用机制，并开发靶向自噬相关通路的药物，将有望为临床中促进创面愈合提供更有效的治疗手段。但自噬在创面愈合中的相关研究仍局限在基础研究层面，且具体作用机制仍不完全清楚，仍存在大量亟待解决的问题，如自噬在创面愈合各个时期的重要性仍有待进一步明确，自噬过分促进瘢痕的形成是否会增加后续抗瘢痕治疗的难度，以及过分促进自噬可能引发一系列并发症等等。

此外，如前文所述创面损伤产生的ROS在抗氧化剂的作用下可促进自噬，减轻凋亡，保护细胞免受氧化应激损害，但其具体机制还不明确，所以笔者认为深入研究ROS作用于自噬和凋亡的具体机制，同时在抗氧化剂的干预下，争取最大化改善细胞活性，这无疑将为后续细胞治疗成功应用于创面修复做铺垫。这将为今后临床工作中应用自噬调控改善创面愈合以及为其治疗提供更多的选择方案。