Box-Behnken响应面法优选蜜炙金银花炮制工艺及其药效学*

张欣荣，李越，许蕊蕊，邱仁杰，齐梵琨，王秀丽

(1.河北省中医院药剂科，石家庄 050011；2.北京中医药大学中药学院，北京 102488；3.南方医科大学外国语学院，佛山 528300)

金银花性寒，味甘，入肺、心、胃经，清热解毒，主治温病发热、热毒血痢、痈疽疔毒等。现代研究证明，金银花含有绿原酸等药理活性成分，对溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等多种致病菌及上呼吸道感染致病病毒等有较强的抑制力，另外还可增强免疫力，有抗炎、解热等作用，其临床用途非常广泛，临床常泡水饮用治疗咽炎。其多用生品，而笔者临床研究发现蜜制金银花具有更好的治疗咽炎效果。《神农本草经》记载：“蜂蜜安五脏之不足，益气补中，止痛解毒，除百病，和百药，久服强志轻身，不老延年[1]。”蜂蜜能抗菌消炎、收敛解毒、祛癖止痛，加快炎症的吸收。众多研究表明[2-4]，绿原酸为金银花治疗急性咽炎的主要药理活性成分，因此笔者以绿原酸含量为主要标准，系统筛选金银花蜜制工艺，并考察其对急性咽炎的治疗效果。

1 材料与仪器

1.1材料 金银花(广州市岭南中药饮片有限公司佛山分公司，批号：1805001)，经北京中医药大学王晶娟副教授鉴定，符合2015年版《中华人民共和国药典》相关项下的要求。蜂蜜(福建新之源生物制品有限公司)。绿原酸对照品(上海融禾医药科技有限公司，含量≥98%，批号：121102)。

1.2仪器 DFT-100A型手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；CP225D 型电子分析天平(Sartorius，感量：0.01 mg)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，300 W，40 kHz)；Waters超高效液相色谱仪(美国Waters公司)，包括二元超高压溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、二极管阵列检测器、Empower色谱工作站；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；喉头喷雾器(澳翔医械有限公司)；全自动血细胞分析仪(景瑞科技基层医疗)。

2 方法与结果

2.1单因素实验

2.1.1加蜜量对绿原酸提取率的影响 称取金银花4份，每份100 g，分别在15%，20%，25%，30%的加蜜量下闷润2 h，将药材置烘箱内，在150 ℃下，烘制12 min。制备供试品溶液，测定绿原酸含量。绿原酸量随加蜜量增加而增加，在加蜜量约为20%时达到最大值，继续增加绿原酸量反而下降，因此最佳蜜量约为20%。

2.1.2闷润时间对绿原酸提取率的影响 称取金银花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下分别闷润1，2，3 h，将药材置烘箱内，在150 ℃下，烘制12 min。制备供试品溶液，测定绿原酸含量。绿原酸量随闷润时间延长而增加，在闷润时间约为2 h时达到最大值，继续增加绿原酸量反而下降，因此最佳闷润时间约为2 h。

2.1.3烘制温度对绿原酸提取率的影响 称取金银花4份，每份100 g，在20%的加蜜量下闷润2 h，将药材置烘箱内，分别在100，120，150，180 ℃下，烘制12 min。制备供试品溶液，测定绿原酸含量。结果表明，绿原酸量随烘制温度升高而升高，在烘制温度约为150 ℃时达到最大值，继续增加绿原酸量反而下降，因此最佳烘制温度约为150 ℃。

2.1.4烘制时间对绿原酸提取率的影响 称取金银花3份，每份100 g，在20%的加蜜量下闷润2 h，将药材置烘箱内，在150 ℃下，分别烘制8，12，16 min。制备供试品溶液，测定绿原酸含量。绿原酸量随烘制时间延长而增加，在烘制时间约为12 min时达到最大值，继续增加绿原酸量反而下降，因此最佳烘制时间约为12 min。

2.2Box-Behnken响应面法优选炮制工艺

2.2.1实验设计及结果 通过前期预实验和单因素实验的考察结果，本实验选取因素为加蜜量(A)，烘制温度(B)，烘制时间(C)和闷润时间(D)等4个因素设为自变量，以绿原酸含量为评价指标，考察各因素对蜜炙金银花的影响，每个因素选取低、中、高3个水平，设计因素水平见表1，实验结果见表2。

表1 设计实验因素与水平

Tab.1Factorsandlevelsoftheexperiment

水平加蜜量(A)/%炮制温度(B)/℃炮制时间(C)/h闷润时间(D)/h-11512081020150122+125180163

2.2.2模型拟合 采用Design-Expert 对上面数据进行分析，见表3。以Y对自变量进行模型拟合，并通过相关系数(R2)等对拟合模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，得到二次多项式回归方程Y=0.56+0.039×B+0.084×C-0.017×D-0.016×A×C-0.015×A×D-0.021×B×C-0.017×C×D-0.025×A2-0.15×B2-0.15×C2，R2=0.940 1，P<0.000 1，F=15.69，表明模型差异有统计学意义；失拟项P=0.126 0，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，实验误差小，可以用此模型对蜜制金银花的制备工艺进行分析和预测。

2.2.3响应面优化分析 根据拟合方程，通过Design-Expert V8.0.6.1版软件绘制评价指标绿原酸随因素变化的等高线图和响应面图，见图1～6。

可见，炮制时间对绿原酸含量的提取呈抛物线形，即随着炮制时间的增长，绿原酸的提取率呈先增大后降低的趋势，但闷润时间对于绿原酸含量的提取并不明显；炮制温度和炮制时间对绿原酸的提取率的影响均呈抛物线形，即随炮制温度和延长炮制时间的同时增大，绿原酸的提取率呈先增大后降低的趋势，因此在提取工艺中适当提高炮制温度和炮制时间可以提高绿原酸的提取率。加蜜量对于绿原酸的提取率几乎没有影响，但随着炮制温度的提高绿原酸的提取率达到最大值，当炮制温度继续升高时，绿原酸含量缓慢降低，因此在实际生产中应将炮制温度控制在最佳范围。

2.2.4验证实验 根据回归模型分析可知，蜜制金银花的最优条件为：20.43%加蜜量，炮制温度153.98 ℃，炮制13.29 min，闷润1 h。按照优化的处方剂量，考虑实际操作的可行性，各因素值保留为整数，即20%加蜜量，炮制温度为154 ℃，炮制13 min，闷润1 h。制备3 批蜜炙银花参样品，测定绿原酸含量分别为0588 6，0.608 1，0.609 9 mg·g-1，RSD=1.96%，与预测值0.606 1 mg·g-1的标准偏差小于5%，说明所得实验结果重复性好，制备工艺稳定。

表2 Box-Behnken响应面法优选炮制工艺实验设计及其结果

Tab.2DesignandresultsoftheoptimizationofprocessingexperimentbyBox-Behnkenresponsesurfacemethod

序号加蜜量(A)/%炮制温度(B)/℃炮制时间(C)/min闷润时间(D)/h绿原酸含量/(mg·g-1)1201501220.535 6212151501230.564 8023251201220.309 0144201801620.374 206520150810.351 635620120820.174 0997201801210.462 8128151501210.570 7179201501220.557 83610201501220.588 73811201801230.432 65012151801220.403 14613201201210.355 25914201501220.588 23415151201220.341 96616201501630.424 84717251501230.553 70918201501220.541 07719251501620.455 6762025150820.262 56921251501210.618 89122201201620.368 54623251801220.405 2512415150820.252 94325201201230.355 15426151501620.510 5882720180820.264 0852820150830.333 81329201501610.509 790

2.3药效学实验

2.3.1大鼠急性咽炎 ①实验方法。采用氨水咽部喷雾的方法建立Wistar大鼠的急性咽炎动物模型：固定大鼠，压舌板压住大鼠舌头以暴露咽部，将浓度为15%的氨水用喉头喷雾器向大鼠咽部喷雾，每次喷3揿，每天上下午各喷1次，连续喷3 d[5]。

表3 方差分析

图1 炮制时间-闷润时间等高线图

Fig.1Contourplotofprocessingtime-moisteningtime

图2 炮制时间-闷润时间响应面图

Fig.2Responsesurfacediagramofprocessingtime-moisteningtime

图3 炮制时间-炮制温度等高线图

Fig.3Contourplotofprocessingtime-processingtemperature

图4 炮制时间-炮制温度响应面图

Fig.4Responsesurfacediagramofprocessingtime-bakingtemperature

图5 加蜜量-炮制时间等高线图

Fig.5Contourplotofhoneycontent-processingtime

图6 加蜜量-炮制时间响应面图

Fig.6Responsesurfacediagramofhoneycontent-processingtime

将大鼠随机分为7组，每组10只，分别为模型对照组、空白对照组、草珊瑚含片组、金银花蜜炙大剂量组、金银花蜜炙小剂量组、金银花大剂量组(未炮制)、金银花小剂量组(未炮制)。按临床用药以人体质量60 kg为标准，参照体表面积剂量换算法计算大鼠给药剂量。草珊瑚含片组420 mg·kg-1·d-1[6]，蜜制金银花大剂量组840 mg·kg-1·d-1，蜜制金银花小剂量组420 mg·kg-1·d-1，金银花大剂量组840 mg·kg-1·d-1，金银花小剂量组420 mg·kg-1·d-1，草珊瑚含片用纯化水配成溶液，金银花水提后过滤浓缩，于造模后喷雾给药，每天上下午各1次，连续喷雾给药 4 d。

②检测指标与结果。动物生存状态观察：实验期间，每日观察记录各组动物外观状态及饮水情况，每日观察动物咽部情况。造模后，大鼠咽喉部位黏液分泌增多，咽部黏膜充血、肿胀呈鲜红色等现象，出现咳喘现象，频频搔抓口部，跳跃不安，大鼠精神状态欠佳、被毛失去光泽[7]。与《中药新药治疗急性咽炎的临床研究指导原则》中本病的诊断标准近似，说明急性咽炎模型造模成功。

血常规检查：造模结束后第1天，各组自眼内眦取血1 mL，检测血常规指标；给药结束后第1天，各组大鼠依照上述方式采血，检测血常规指标。大鼠血常规检测结果见表4。

表4 大鼠血常规检测结果

Tab.4Resultsofbloodroutineexaminationinrats

组别中性粒细胞淋巴细胞空白对照组3.41±0.075.52±0.06模型对照组2.98±0.13①6.85±0.06①草珊瑚含片组3.32±0.06②5.49±0.09②蜜炙金银花 大剂量组3.40±0.07②5.57±0.06② 小剂量组3.20±0.06②6.23±0.07②金银花 大剂量组3.25±0.09②6.16±0.07② 小剂量组3.12±0.10②6.46±0.07②

①与空白对照组比较，t=62.82，42.10，P<0.01；②与模型对照组比较，t=-40.53～3.20，P<0.01。

①Compared with blank control group，t=62.82，42.10，P<0.01；②Compared with model control group，t=-40.53-3.20，P<0.01.

造模后，模型对照组与空白对照组比较，大鼠血液中性粒细胞数目明显减少(P<0.01)，淋巴细胞数目明显增加(P<0.01)，表明动物模型建造成功。给药4 d后，与造模不给药组比较，草珊瑚含片组、蜜炙金银花大剂量组、蜜炙金银花小剂量组、金银花大剂量组、金银花小剂量组中的中性粒细胞数量逐渐恢复，且各组中的淋巴细胞数量有所下降，说明蜜炙金银花、金银花和草珊瑚含片草珊瑚含片均对咽炎有一定的治疗作用。此外，蜜炙金银花大剂量组与草珊瑚含片组比较，中性粒细胞数量恢复更多(t=-2.53，P=0.0241)；而淋巴细胞降低较少(t=-2.14，P=0.0508)，故蜜炙金银花比草珊瑚含片对急性咽炎的治疗作用稍好。

2.3.2小鼠耳廓肿胀炎症 ①实验方法。将大鼠随机分为7组，每组12只，分别为模型对照组、空白对照组、阿司匹林组、蜜炙金银花大剂量组、蜜炙金银花小剂量组、金银花大剂量组(未炮制)、金银花小剂量组(未炮制)。按临床用药以人体质量60 kg为标准，参照体表面积剂量换算法计算小鼠给药剂量。动物每天灌胃给药1次，连续3 d，模型对照组和空白对照组给予等量纯化水。末次给药后30 min，用移液枪吸取二甲苯0.05 mL均匀滴于小鼠右耳前、后面，左耳作为对照。2 h后将小鼠处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9 mm的打孔器分别在左、右耳同一部位冲下圆耳片，称质量。以左右耳片质量之差作为肿胀度并计算抑制率，比较组间差异。

抑制率(%)=(模型对照组肿胀度-给药组肿胀度)/ 模型对照组肿胀度×100%

②实验结果。与空白对照组比较，模型对照组小鼠耳部的肿胀度明显(t=6.65，P<0.01)。与模型对照组比较，蜜炙金银花组和未炮制金银花组小鼠耳部的肿胀度均显著降低(t=9.42,P<0.01)，见表5。

表5 金银花对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

组别肿胀度/mg抑制率/%空白对照组0.84±0.11-模型对照组20.56±3.25①-阿司匹林组9.86±4.36②52蜜炙金银花 大剂量组10.49±3.78②48 小剂量组12.20±4.58②41金银花 大剂量组12.35±3.69②39 小剂量组13.86±5.10②32

①与空白对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01。

①Compared with blank control group,P<0.01；②Compared with model control group,P<0.01.

3 讨论

与常用的均匀设计、正交设计等比较，Box-Behnken响应面法采用多元线性和二次项模型拟合能提高实验精确度并预测最佳点。故本实验采用Box-Behnken响应面法优化蜜炙金银花炮制工艺，同时确定了炮制工艺4个主要影响因素加蜜量、炮制温度、炮制时间、闷润时间的具体参数，对于饮片炮制规范生产有一定的指导意义。

大鼠急性咽炎药效实验中，笔者将中性粒细胞和淋巴细胞作为检测指标，且已有大量实验表明这些指标对于咽炎的治疗具有参考价值[8-9]。由于氨水刺激造成模型对照组大鼠免疫系统损伤而使得模型对照组中性粒细胞减少，而蜜炙金银花使其升高，降低其游走、吞噬、消化等功能，因而减弱对炎症区的浸润与吞噬作用[10]。且经有效化学刺激产生的炎症，病理学表现为炎症细胞浸润明显，其中以淋巴细胞等为主[11]。在炎症反应中，淋巴细胞比例增加，而蜜炙金银花可以降低全血中淋巴细胞，使炎症减轻，因此蜜炙金银花相对于普通金银花有更好的治疗急性咽炎的药理作用。